中分子量羟乙基淀粉对脊髓压迫伤后神经痛的作用

刘宏波，宋振全，梁国标，王志军，赵明光，赵 旭，雷 伟，李 宾

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是交通、工矿事故及运动意外中的常见损伤，是一种严重危害人类健康的疾病。资料显示，世界上脊髓损伤患者超300 万［1］，SCI后神经病理性疼痛(neuropathic pain)的发生率很高(40% ～50%)［2］。其中，中枢性疼痛(central pain，CP)为SCI的顽固性并发症［3］，近年来其发病率有逐年增高的趋势，但其发病机制目前尚不清楚，临床治疗效果并不令人满意。目前认为既有外周神经敏化又有中枢神经系统敏化，除受损神经敏化，未受损神经以及胶质细胞也参与发病过程［4］，尤以神经胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞)及神经胶质细胞与神经元的相互作用在SCI后的CP中扮演重要角色，其作用主要通过分泌多种细胞因子得以实现［5－6］。另外，神经病理性疼痛一般均伴有血管功能异常及炎症现象［7］，而就脊髓损伤而言，血管结构和神经成分的破坏导致复杂剧烈的炎症反应，神经胶质细胞连同外周血白细胞在其中起到重要的作用［8－9］。脊髓损伤后的神经胶质细胞将炎症反应与CP的发生联系在一起。血脊髓屏障(blood spinal cord barrier，BSCB)是血脑屏障的一部分，功能在于维持脊髓内环境稳定;脊髓损伤后，不仅破坏脊髓的实质，同时破坏了血管的结构，损伤内皮细胞，BSCB也不可避免地遭到破坏，对受损脊髓炎症反应的发生、发展有着重要的作用［10］。

羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)是一种血容量扩张剂，有维持血液胶体渗透压的作用，从上世纪60年代起，作为容量替代和血液稀释的血浆代用品开始在临床上大量使用［11－12］。除了其胶体扩容作用，中等分子量HES(100～1000 kD)还可以改善血管内皮细胞的功能，防止和堵塞毛细血管漏，减轻BSCB开放;全分子量HES(10～3400 kD)无该作用，低分子量HES的作用尚无相关报道［13－17］。

本实验研究大鼠SCI模型建立后通过给予HES(中分子量和小分子量)，探讨其对中枢性疼痛的作用。

材料与方法

1 实验动物及分组

SD雄性成年大鼠48只，由锦州医学院实验动物中心提供，体重200～230g。随机分入脊髓压迫损伤组(A组)，脊髓损伤联合低分子量HES治疗组(B组)，脊髓损伤联合中分子量HES治疗组(C组)，以及假手术组(D组)，每组12只。假手术组仅行椎板去除术，A组、B组和C组在脊髓损伤模型建立后经尾静脉按15ml/kg给予生理盐水、低分子量HES(HES 40，706代血浆，平均分子量40)、中分子量HES(HES 130/0.4，万汶，德国费森尤斯卡比股份有限公司，平均分子量130kD，取代级0.4)，5% ×动物血容量/次，2次/d。各组在模型建立后3d测BSCB破坏情况(n=5)，10d进行行为学观察、形态学观察和分子生物学检测。本实验符合锦州医学院动物实验伦理委员会要求。

2 脊髓压迫伤模型［18］

所有器械经高压蒸汽灭菌。大鼠用10%水合氯醛作腹腔麻醉(0.35ml/100g)后，取俯卧位，于显微镜下，将大鼠T7、T8双侧椎弓根切断，随后取下椎板，紧接着植入一种吸水膨胀材料(医用PU泡棉)，随着压迫物的膨胀逐渐形成不同程度的慢性压迫脊髓损伤实验动物模型。术后逐层缝合肌肉和皮肤后回笼饲养，定时定量给以软饲料喂养，饮水不加限制。术后开始每日腹腔注射青霉素8万U/只，庆大霉素0.2万U/只，预防术后感染，维持7d。术后大鼠每日行膀胱按摩人工排尿2次，直到动物恢复排尿反射。

3 疼痛行为学测定

机械性痛觉过敏:以不同粗细和不同长度的尼龙丝制成14个刺激强度不同(1.0～60g)的机械刺激器(von-Frey纤维)。将一20cm×20cm×25cm的透明有机玻璃罩放置于金属丝制成的网格垫上，将待测大鼠置于罩中。使其适应30min后试验者手持von-Frey纤维穿过金属丝网格分别刺激大鼠两侧足底中心部位，刺激强度由小到大，每个强度反复刺激5次(每次间隔3～5s)，将出现50%以上缩足反射的强度定为大鼠对机械性痛敏压力阈值(paw withdrawal pressure threshold，PWPT)。如以60g von-Frey纤维刺激大鼠足底仍不出现缩足反射，则认为大鼠无痛反应;机械刺激阈值＜0.1g均以0.1g计:这种刺激的原理是当尼龙纤维受阻弯曲后其尖端压力不变，故可以认为每个测量值都是恒定的。

热痛觉过敏:将大鼠置于20cm×20cm×25cm的透明有机玻璃罩中，底部为距试验台30cm的2mm厚的玻璃板。应用RTY 3型热刺激仪(西安凤岚仪器厂)。选择100W卤素投射灯，调节电压至10V，调节灯源与玻璃板之间的距离，使落在足底的照射光圈直径为5mm，记录从开始照射至出现缩足逃避反射的时间(s)，作为热痛敏反应潜伏期(paw withdrawal latency，PWL);重复测量3～5次，同一部位间隔10min，不同部位间隔5min，取平均值为热痛敏反应潜伏期并作为定量指标。如＞40s无反应则停止照射，以免导致足底组织过度热损伤。

4 脊髓组织伊文氏蓝(EB)含量的测定

伤后3d的大鼠，经大鼠固定器后经尾静脉注射2%EB(2ml/kg体重)，20min后迅速断头取脊髓(以损伤节段为中心约2.5cm长)，剥除硬脊膜并洗去血凝块，称重并置于等体积甲酰胺中，置37℃水浴48h，在波长632nm处测光密度值(OD)。

5 组织学观察

动物于相应时间以10%水合氯醛作腹腔麻醉(0.35ml/100g)后，灌注固定后取出损伤区吻端2.5cm到马尾的脊髓并置于含25%蔗糖的4%多聚甲醛溶液中，至标本沉底。每例脊髓取两段:Ⅰ，第一段损伤区为中心的1.6cm节段，Ⅱ，第二段L3～S4节段，冰冻切片机(德国，Leica公司)以10μm厚连续切片。

切片行免疫荧光双重标记:一抗:兔源抗神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多抗(1:500，Sigma)，兔源抗小胶质细胞(Iba1)单抗(1∶400，Sigma)，小鼠源抗单核巨噬细胞抗原1(ED1)单抗(1:400，Sigma)。二抗:偶联异硫氰酸荧光素(FITC)山羊源抗兔二抗(1:500，Sigma)，偶联德克萨斯红(TRITC)的兔源抗小鼠二抗(1:400，Sigma)。着色完毕封片后，在激光扫描共聚焦显微镜(FV1000系统，奥林巴斯公司)上观察并采图。

6 脊髓组织蛋白提取和定量

各组大鼠分别在相应时间随机取4只，腹腔麻醉、断头取以损伤区为中心的1.6cm节段和L3～S4节段，装入5ml灭菌离心管并立即置于液氮中保存备用。组织块称量、切碎，置于含0.5%Triton X-100的磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH 7.0，20mmol/L)内，4℃浸泡24h，组织浓度标准化至400mg/ml。浸泡后，12 000r/min(4℃)离心 20min，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度后，调至相同浓度，收集上清液并分装，－80℃冰箱保存。

Western blotting检测分析星形胶质细胞(GFAP)、小胶质细胞(Iba1)、活化小胶质细胞/巨噬细胞(ED1):每孔样本上样量为350μg/L，所用分离胶的浓度为120ml/L。将样本加入凝胶样本孔中，以70V的条件进行SDS-PAGE凝胶电泳;结束后，以110V的条件转膜3h;用100g/L脱脂奶粉封闭1h后与抗AIP抗体(1:400稀释)4℃反应过夜;经洗涤后再与二抗反应3h，最后用western blot蛋白质印迹法(ECL)化学发光底物检测膜上的抗原抗体复合物。

酶联免疫吸附法(ELISA)定量检测IL-1、IL-6、TNF-α，试剂盒购自美国Abcam公司。具体操作步骤按试剂盒说明书的操作方法进行。

7 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行分析，本课题研究结果均以P＜0.05为有统计学意义。

结 果

1 HES对血脊髓屏障的影响

根据前期实验结果，脊髓压迫损伤后BSCB便遭到破坏，伤后3d即达最大值，7d基本恢复正常。本实验选择在伤后3d对各组间BSCB破坏程度进行比较:A组脊髓实质内EB含量明显高于假手术组(D组)，B组与A组间无统计学差异，C组EB含量显著低于A组和B组，差异有统计学意义(图1)。

2 HES 对慢性中枢性疼痛的作用

脊髓压迫损伤后可造成后肢瘫痪，伤后8～12d达到足底着地程度，运动功能逐渐恢复，此时才能得到稳定的疼痛阈值。本实验对术前1d和术后10、14、20、30、60d 各组大鼠的 PWPT 和 PWL 进行测量。术前各组间PWPT和PWL无显著性差异。A组术后10d始，PWPT和PWL均显著降低，且随后各时间点较10d无明显差异;B组术后各时间点较A组未见明显差异;C组术后所测时间点的PWPT和PWL均较A组和B组明显升高(图2)。

图1 伤后3d，脊髓组织内EB含量

图2 机械痛敏和热痛敏比较

3 HES对炎症反应的影响

据报道，脊髓压迫损伤后，活化小胶质细胞/巨噬细胞反应在伤后7d达到高峰，本实验选择在伤后7d比较各组炎症反应程度。

对损伤段脊髓组织GFAP表达量进行观察，组间均未见差异;Iba1和ED1分别为巨噬细胞/小胶质细胞内钙结合蛋白和溶酶体膜蛋白标记物，可反映巨噬细胞/小胶质细胞活化程度。伤后10d，损伤段:D组各时间点均可表达一定量Iba1和少量ED1，A组两者的表达较D组有明显上调，B组较A组无明显变化，同时刻C组较A组和B组均明显下降(图3、4)。

对伤后7d脊髓炎性细胞因子表达IL-1、IL-6、TNF-α进行观察:损伤段A组与B组间未见明显差异，D组高于A组和B组，而C组较A组和B组均明显下降(图5)。

图3 损伤段脊髓伤后7d，活化小胶质细胞/巨噬细胞观察

图4 损伤段脊髓伤后7d，星形胶质细胞(GFAP)、活化小胶质细胞/巨噬细胞(Iba1，ED1)特异性标记物表达

图5 损伤段脊髓伤后7d，IL-1、IL-6、TNF-α细胞因子表达

讨 论

中枢神经系统损伤后，神经轴突难以再生，导致神经功能无法正常恢复，患者在损伤平面以下存在感觉、运动、反射及尿便功能障碍［19－20］。而中枢性疼痛为脊髓损伤的顽固性并发症。其致病机制尚不明确，至今仍无有效的治疗手段。目前有文献报道胶质细胞的活化以及一些细胞因子和趋化因子(IL-1等)与脊髓损伤后中枢性疼痛密切相关［21］。在脊髓损伤后，组织发生水肿、缺血低氧，并且血浆内的各种分子无选择性地进入脊髓实质内部，进而诱发一系列继发性损伤并加重脊髓的损伤。BSCB的破坏范围也随之扩大，其结构功能的异常导致血液成分、外周炎性成分大量进入脊髓实质，脊髓内的胶质细胞被激活［21－25］，从而外周单核巨噬细胞和活化的小胶质细胞参与到脊髓损害后炎症反应［26－27］。

中分子量的HES可通过多种机制抑制毛细血管漏，挽救异常通透的BSCB，而其他分子量HES无此作用［28－29］。本实验结果显示SCI动物脊髓损伤区BSCB通透异常增高，伤后2～3d达到最大值，给予HES 130/0.4可以使之显著缓解，HES 40组(对照组)未见相应效果。而SCI后行为学观察后肢PWPT和PWL明显降低，HES 130/0.4组痛阈显著回升，HES 40组则对痛阈没有影响。上述实验结果都表明HES 130/0.4可以缓解SCI后CP的程度，而其机制很可能为挽救异常通透的BSCB。HES 130/0.4在脊髓损伤区节段可降低巨噬细胞/小胶质细胞活化程度，并使损伤区的趋化因子表达下调。可以说明IL-1、IL-6、TNF-α 表达下调可能为 HES 130/0.4 缓解CP的机制之一;而这些细胞因子在受损脊髓主要由活化的巨噬细胞/小胶质细胞所分泌，所以给予HES 130/0.4后巨噬细胞/小胶质细胞活化水平的下调可以进一步支持上述推测。HES 40组未见HES 130/0.4的上述作用，可以说明低分子量HES对脊髓损伤后BSCB破坏没有缓解作用，亦间接地说明扩容作用不是HES 130/0.4改善脊髓损伤后并发炎症和CP的机制。

综上所述，本实验结果说明HES 130/0.4对脊髓损伤后并发的中枢性疼痛有缓解作用，其机制可能为通过改善异常通透的BSCB来抑制其损伤区域的炎症反应。目前，通过干预脊髓损伤后炎症反应来影响中枢性疼痛的研究国内外少有报道;通过调节BSCB功能来干预脊髓损伤中枢性神经病理性疼痛的研究尚处于初级阶段，相应的机制研究亦较少，很多还停留在脊髓损伤后BCSB与继发性损伤的相关研究中。通过少量研究报道，我们发现炎症反应在脊髓损伤后并发症中发挥着重要作用。对该机制的研究，可能优化我们现有治疗的方法，为脊髓损伤后的诊治提供一个新的思路。

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