沉默Notch4基因对乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖和迁移侵袭能力的影响

任宗娜

（天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津300060）

论著

沉默Notch4基因对乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖和迁移侵袭能力的影响

任宗娜

（天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津300060）

目的：探讨Notch4基因对乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖、迁移侵袭能力的影响。方法：脂质体法用Notch4 siRNA转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231，RT-PCR和Western blot检测Notch4基因的表达，通过MTT实验评价MDA-MB-231细胞增殖活性的改变；流式细胞术检测细胞周期，通过Transwell实验评价肿瘤细胞迁移和侵袭能力的改变；RT-PCR方法检测Notch信号通路相关基因的变化。结果：Notch4 siRNA有效地转入细胞并抑制了Notch4基因的表达。转染Notch4 siRNA细胞的增殖活性及体外迁移侵袭能力均显著下降（P<0.05）。细胞周期阻滞在G0/G1，Hes1、Hey1、c-Myc、cyclinD1、MMP9 mRNA水平明显低于对照组（P<0.05）。结论：Notch4 siRNA可明显抑制乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭能力。Notch4基因可做为三阴性乳腺癌基因治疗的靶基因。

Notch4基因；乳腺癌；RNA干扰；增殖；迁移；侵袭

三阴乳腺癌（triple-negativebreastcancer，TNBC）是以雌激素受体α（estrogen receptorα，ERα）、孕酮受体2（progesterone receptor 2，PR）和人表皮生长因子受体（human epidermal growth factor receptor，HER-2）均不表达为特点的乳腺癌细胞[1]，占所有乳腺癌细胞的10%～15%[2-4]，由于缺乏针对这些受体的有效治疗靶点，无法采用内分泌治疗和曲妥单抗治疗，导致预后较差[5]。化疗存在疗效不稳定、副作用大以及多药耐药等问题，因此，急需找到针对TNBC的有效的分子治疗靶点。Notch信号通路广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物，在进化上高度保守，通过相邻细胞之间的相互作用调控胚胎发育、血管发生、程序性细胞死亡和细胞增殖等多种生理过程[6-9]，在肿瘤的侵袭、转移、凋亡、增殖和血管生成等病理过程中也发挥着关键作用[10-11]。目前在脊椎动物中共发现 4个同源体 Notch1、Notch2、Notch3、Notch4[12]。Speiser等[13]研究发现Notch4是三阴性乳腺癌的一个生物学标志物。本研究利用RNAi技术沉默乳腺癌细胞系MDA-MB-231的Notch4基因，观察其对乳腺癌细胞系MDA-MB-231的增殖、迁移和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 乳腺癌细胞系MDA-MB-231具有间质特性和高转移能力，来源于美国标准生物品收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。MDA-MB-231细胞培养于含10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS；GIBCO公司，美国）的RPMI-1640培养基（GIBCO公司，美国）中。将对数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，用于体外和体内实验。

1.2 siRNA细胞转染 采用Lipofectamine 2000脂质体转染，方法按照说明书。接种1×105个细胞/孔于6孔板，以含血清无抗生素的培养基培养，细胞为30%～50%饱和度时用于转染(表1)。将5 μL（100 pmol）的stealth RNAi加入含有250 μL的Opti-MEM（GIBCO公司，美国）的EP管中，轻轻混匀；将5 μL的 Lipofectamine 2000加入含有 250 μL的Opti-MEM的EP管中，轻轻混匀；室温静置孵育5 min；将上述液体混合，室温静置孵育20 min；将上述混合液缓慢滴入含有1.5 mL OPTI-DMEM无血清培养基的细胞中，4～6 h后换成含10%FBS的培养液。转染48 h后裂解细胞提取总RNA及免疫荧光检测。实验分组：实验组（Notch4 siRNA组）；阴性对照组（NC siRNA组）；空白对照组（Mock siRNA组）。

表1 siRNA干扰序列Tab 1 The sequences of siRNA oligonucleotides

1.3 MTT 细胞胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液。细胞悬液接种于96孔板，细胞计数调整其浓度至3 000个细胞/孔，边缘孔用无菌PBS填充，5%CO2，37℃孵育。设置6个复孔，分别处理1、2、3、4 d后，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2～3遍后，再加入含MTT的培养液。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值。

1.4 QTR-PCR 提取细胞总RNA，cDNA的合成，QPCR反应。每个样本中每个基因的检测均重复3次。CT值为荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数，ΔCT值为各样本中目的基因的CT值与管家基因GAPDH的CT值之差，2-△Ct则为该样本中目的基因相对于GAPDH mRNA的表达量。管家基因GAPDH和目的基因的引物序列均采用Oligo6.0软件设计，引物及探针均由上海生工生物工程公司合成（表2）。

表2 引物序列Tab 2 Primer sequence

1.5 流式细胞仪检测细胞周期 收集转染后72 h各组细胞，乙醇固定过夜，RNA酶水浴加热消化后加入碘化丙啶（PI，50 μg/mL），4℃放置15 min后流式细胞仪检测。

1.6 细胞侵袭和迁移实验 将悬浮于500 μL无血清培养基的5×104个231-siNotch4、231-siControl细胞接种于含Metrigel和不含Metrigel的transwell上室，下层加入750 μL含10%FBS的细胞培养液，培养8 h。取出transwell小室，用棉签拭去上层未穿过的细胞，通过3步染色试剂盒（Thermo Scientific公司，美国）固定、染色，自来水漂洗3次，室温风干，中性树胶固定，于镜下观察穿孔细胞数目，随机选取5个视野计数并取其平均值。

1.7 Western blot检测 使用细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳。将蛋白膜转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，加入鼠一抗Notch4（1∶1 000），4℃转动过夜。第2天取出膜，TBST漂洗后，加入羊抗鼠二抗反应，室温孵育1 h，TBST漂洗。化学发光法（ECL）显影，暗室曝光。

1.8 统计学方法 体外细胞学实验均设每组3个复孔细胞，实验数据用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。统计学分析采用SPSS 13.0软件进行处理。

2 结果

2.1 倒置荧光显微镜下观察实验细胞 绝大多数细胞都荧光着色，与背景反差明显，荧光着色细胞有明显的细胞轮廓（图1）。

图1 转染48 h后倒置荧光显微镜下观察转染后实验细胞（x100）Fig 1 MDA-MB-231 cells under fluoroscope at 48 h after transfection(x100)

2.2 RT-PCR和Westernblot检测Notch4的表达 肿瘤细胞体外运动能力的变化RT-PCR和Western blot结果显示，与阴性对照组和空白对照组相比，实验组Notch4的表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图2 Notch4 siRNA对乳腺癌细胞系MDA-MB-231 Notch4 mRNA和蛋白水平表达的影响（*P＜0.05）Fig 2 Effect of siRNA on Notch4 mRNA and protein expression in MDA-MB-231 cells（*P＜0.05）

2.3 MTT法检测各组细胞的增殖活性 转染Notch4 siRNA后第1、2天，各实验组增殖活性无明显差异，48 h的OD值，Notch4 siRNA组：0.48±0.07，NC siRNA组：0.51±0.12，Mock siRNA组：0.54±0.17，无明显统计差异（P＞0.05）。Notch4 siRNA组较其他两组在第3～5天出现差异，第4天差异最明显，此时Notch4 siRNA组OD值：0.93±0.08，NC siRNA组OD值：1.26±0.29，Mock siRNA组OD值：1.3±0.08，比较有统计学差异（P＜0.05）。以时间为横轴、OD值为纵轴绘制生长曲线（图3）。

图3 转染Notch4 siRNA对乳腺癌细胞系MDA-MB-231增殖的影响Fig 3 The growth curve by the MTT assay in different groups of MDA-MB-231 after transfection with Notch4 siRNA

2.4 流式检测细胞周期变化 由于细胞的增殖与细胞周期密切相关，在观察到siRNA介导的Notoh4下调能够抑制MDA-MB-231细胞的增殖后，利用流式细胞仪检测了MDA-MB-231细胞在转染siRNA 72 h后的细胞周期分布。结果MDA-MB-231细胞在转染后其典型细胞周期分布为G1：52.3%，G2：17.8%，S：30%；而对照组细胞的周期分布为Gl：71.8%，G2：15.8%，S：12.4%；呈G0/G1阻滞（图4）。

图4 Notch4沉默后对乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞周期的影响Fig 4 The effect of Notch4 siRNA on cell cycle progression ofMDA-MB-231 cells

2.5 沉默Notch4基因对乳腺癌细胞系MDA-MB-231体外迁移侵袭能力的影响 增殖抑制实验表明，Notch4基因沉默后第3天开始出现差异。因此，为了减少细胞增殖对迁移侵袭实验的影响，检测迁移侵袭能力的实验选定在转染后24～48 h进行。结果显示Notch4 siRNA组与其余两组相比，细胞的迁移、侵袭能力显著下调，差异有统计学意义（P＜0.05）（图5）。

2.6 RT-PCR检测基因表达 RT-PCR检测转染72 h后，Notch4 siRNA组、NC siRNA组、Mock siRNA组的不同基因的表达。结果显示Hes1、Hey1、c-Myc、cyclinD1 mRNA表达均明显低于其他两组（P＜0.05）（图6）。

图5 Notch4沉默后对乳腺癌细胞系MDA-MB-231体外运动能力的影响（*P＜0.05）Fig 5 The effect of Notch4 siRNA on migration and invasion activity of MDA-MB-231 cells in vitro（*P＜0.05）

图6 转染后MDA-MB-231细胞的Hes1、Hey1、c-Myc、cyclinD1、MMP9 mRNA表达的差异（*P＜0.05）Fig 6 The expression of Hes1,Hey1,c-Myc,cyclinD1 and MMP9 in MDA-MB-231 cells after transfection（*P＜0.05）

3 讨论

Naik等[14]研究发现，Notch4异常高表达与乳腺癌的发生和发展密切相关，而且在Basal乳腺癌细胞中高表达。在高表达Notch4的乳腺癌细胞中，Notch4增加细胞的抗凋亡能力，提高对化疗药的耐受性[14]。研究发现，活化的Notch4还可以使正常乳腺上皮细胞在体外发生恶性转化[15]。Lombardo等[16]研究发现，MCF-7细胞高表达Notch4受体，使细胞发生上皮间质转化，增加对内分泌治疗的不敏感性。临床资料显示[17]，Notch4高表达的肿瘤患者，其总体生存较短。所以，Notch4基因高表达是乳腺癌患者的不良预后因素。

在细胞周期检测中，沉默Notch4基因后细胞发生了G0/G1阻滞，提示Notch4蛋白是通过促进细胞周期诱导细胞增殖。细胞周期素D1（cyclinD1）属细胞周期素家族成员，可与CDK4结合并激活其活性，调控细胞由G1期至S期的转变。本实验证实抑制Notch4基因的表达能下调cyclinD1，进而阻止人乳腺癌MDAMB-231细胞从G1期进入S期，所以靶向Notch4的药物能缓解乳腺癌细胞的增殖速率。原癌基因c-Myc是决定细胞从G0/G1期进入S期的“开关”，而且在G2/M细胞周期进展中也起着重要作用，与细胞增殖关系密切[18-20]。使用RNA干扰技术沉默c-Myc基因能有效抑制肾癌细胞增殖[21]。张巧琳等[22]发现c-Myc抑制剂能抑制肾癌细胞786-0的增殖并发生G0/G1期细胞周期阻滞。以上研究说明c-Myc基因与细胞的增殖和周期密切相关，同样，我们发现抑制Notch信号通路后乳腺癌细胞增殖受到抑制，而且停留在G0/G1期的细胞比例明显升高。c-Myc与Notch4信号通路在生物学行为上具有相似性，两者可能存在协同性。在本实验中，我们采用小干扰沉默乳腺癌细胞株MDA-MB-231的Notch4蛋白后c-Myc的mRNA水平下调，说明在乳腺癌中c-Myc可能也作为Notch4蛋白的靶基因而发挥作用。本研究发现，在沉默Notch4基因后Hes1和Hey1 mRNA表达水平均明显降低。Notch信号传导是通过信号发出细胞的配体结合信号接收细胞的受体由γ-内分泌酶切除受体胞内段使其激活。胞内段入核后与转录因子CSL形成复合体，调节下游靶基因的表达，可见，Notch信号主要功能取决于下游靶基因的功能。下游靶基因主要是Hes/ Hey家族，转录后主要参与细胞增殖、分化、凋亡等从而决定细胞命运。MMP9是基质金属蛋白酶家族中的成员之一，主要作用就是降解基质中的蛋白，与乳腺癌的侵袭性、转移密切相关[23]。本实验发现，在沉默Notch4基因后MMP9的mRNA表达水平均明显降低，提示在MDA-MB-231细胞中Notch4基因可能通过下调MMP9的水平，抑制细胞的迁移、侵袭能力。

综上所述，本实验证实了通过沉默Notch4的表达可明显抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移、侵袭能力，结合Notch4在增强乳腺癌细胞干性、抗凋亡和耐药性等方面的作用，我们认为靶向Notch4的治疗是可行的，将有可能为三阴性乳腺癌基因治疗的一种新选择。

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（2015-05-06收稿）

Inhibition effect of silencing Notch4 gene on the proliferation and migration and invasion activity of breast cancer cell line MDA-MB-231

REN Zong-na
（Cancer Institute and Hospital，Tianjin Medical University，National Clinical Research Center of Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China）

Objective：To investigate the effect of Notch4 gene on the proliferation and migration and invasion activity of breast cancer cells.Methods：Lipofectin Reagent was used to transfect Notch4 siRNA into breast cancer cell MDA-MB-231.The mRNA and protein expression level of Notch4 were detected by RT-PCR and Western blot.Cell grow curve was measured by MTT assay.Matrigel-coated Transwell and Transwell inserts were applied to examine cell migration and invasion activity in vitro.The cell cycle distribution was assessed by flow cytomentry.The expression levels of Hes1,Hey1,c-Myc,cyclinD1 and MMP9 were detected by RT-PCR.Results：The Notch4 siRNA was effectively transfected into MDA-MB-231 cells.The mRNA and protein expression level of Notch4 were inhibited.MTT test showed that the proliferation of transfected cells was significantly lower than those of the other two groups(P<0.05).Transwell chamber testshowed thatthe migration and invasion capability of transfected cells was significantly lower than control(P<0.05).Cell cycle of Notch4 siRNA transfected group cells was arrested in G0/G1 phase.The expression levels of Hes1,Hey1,c-Myc,cyclinD1 and MMP9 between Notch4 siRNA transfected group and other two groups were statistically different(P<0.05).Conclusion：Notch4 gene by Notch4 siRNA can remarkably inhibitproliferation and migration and invasion activity of cell lines of MDA-MB-231.Notch4 gene may be used as the target for triple-negative breastcancer gene therapy.

Notch4 gene；breast cancer；RNAi;proliferation；migration；invasion

R737.9

A

1006－8147（2015）06-0469-05

任宗娜（1989-），女，硕士在读，研究方向：生物化学与分子生物学；E-mail：zongnaren@163.com。