红景天(Rhodiolarosea)中红景天苷的提取工艺研究

王兴芳，李莹，宋金国，肖雯

(1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州　730070；2.甘肃农业大学理学院，甘肃 兰州　730070)



红景天(Rhodiolarosea)中红景天苷的提取工艺研究

王兴芳1，李莹1，宋金国2，肖雯2

(1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州730070；2.甘肃农业大学理学院，甘肃 兰州730070)

摘要：为了确定红景中红景天苷的最佳提取工艺.试验采用乙醇回流提取法、索氏提取法和超声波提取法对红景天中的红景天苷进行提取，综合分析选出最佳提取方法；并优化最佳提取方法，采用单因素试验设计，考察乙醇体积分数、提取剂pH值、提取时间、料液比4因素对红景天苷提取率的影响；进一步根据单因素试验的结果设计响应面分析试验，确定最佳提取条件.结果表明：超声波提取法为最佳提取方法，最佳提取条件为：乙醇体积分数57%，pH7.66，料液比1∶19，时间71 min，红景天苷的提取率为0.89%.研究结果为有效利用红景天资源及其工业生产提供了科学依据.

关键词：红景天；红景天苷；提取工艺

第一作者：王兴芳(1986-)，女，硕士研究生,研究方向为植物天然成分提取.E-mail：18893704348@163.com

红景天(Rhodiolarosea)是景天科红景天属植物，在世界上有90余种.多分布在北半球的高寒地带，大都生长在海拔3 500～5 000 m高山流石或灌木丛林下[1].景天属植物国内外进行过化学成份研究及成分预试的种约30个.国内开始预试和正在预试的种有16个，从上述种中巳分离出9大类(香豆素类、黄酮类、苷类、生物碱类、无机元素、氨基酸、纤维素类、淀粉类、维生素)[2]60多种新化合物.因红景天(Rhodiolarosea)具有治疗心血管疾病、增强机体免疫力、抗应激反应、抗衰老、抗辐射等功效，广泛应用于保健和临床[3-4].吴丹[5]发现红景天提取物对乳腺癌、宫颈癌的治疗能起到一定作用.

目前国内对于红景天苷的提取和检测方法有很多种，杨志红等[6]采用正交试验法，以红景天主要成分红景天苷的含量为指标，比较了乙醇回流提取和超声波提取两种方法，结果表明超声提取试验对工艺的稳定性提供了保障，使其原工艺更具科学性，可控性.罗智敏等[7]采用超声、回流、冷浸3种方法对狭叶红景天中的红景天苷进行提取，结果表明，回流提取为最适提取方法.程子毓等[8]用超声波法水提取红景天，采用L16(45)正交试验法，以粗提物中红景天苷的含量为指标优选提取工艺.超声波法提取最佳方案为:溶剂为40 ℃高纯水，料液比为1∶20，浸泡时间为1 h，提取温度为60 ℃，提取时间为30 min，提取次数为4次.翟旭峰等[9]和陈玉婷等[10]都采用HPLC法测定红景天苷的含量.李莹等[11]采用超声波提取法分别用5种不同极性的提取剂对唐古特红景天的化学成分进行提取，结果共鉴定出64种成分，并计算出了利用超声波法提取红景天苷提取率为0.92%.为了进一步研究优化红景天苷的最佳提取方法和最佳提取条件，本研究使用3种不同的提取方法通过响应面试验确定了最佳提取工艺，以期为进一步有效利用红景天资源及其工业生产提供科学依据.

1材料与方法

1.1试验材料

红景天采于甘肃省蒙古族自治县盐池湾国家级自然保护区.红景天的根茎用超纯水洗净，100 ℃下烘干，粉碎后过120目筛备用.红景天苷(Salidroside)对照品购自上海原叶生物有限公司(批号：110818、200404).

1.2试验试剂

甲醇、乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯；0.45 μm有机微孔滤膜、甲醇(色谱纯)、超纯水(自制)、 4 mol/L硫酸和4 mol/L NaOH.

1.3试验仪器

DS-2510DT超声波提取仪(上海奥普勒仪器有限公司)；RE-2000B旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；JLL350-B型高速多功能搅拌机(顺德市科顺塑料电器实业有限公司)；6A系列HPCL高效液相色谱仪(日本岛津)；0.45 μm有机滤膜、SHZ-(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；AL104电子天平(上海梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；HG101-3A电热鼓风干燥箱(南京腾飞实验仪器有限公司)；回流装置；索氏提取器.

1.4试验方法

1.4.1乙醇回流提取称取红景天粉末10.00 g于蒸馏烧瓶中加200 mL70%乙醇回流提取(回流3次、每次50 mL、1.5 h).将提取液纯化：分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯除杂，然后用正丁醇萃取，萃取液过0.45 μm有机微孔滤膜待测.

1.4.2索氏提取称取红景天粉末10.00 g于索氏提取器中，用200 mL甲醇进行索氏提取6 h，将提取液纯化：分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯除杂，然后用正丁醇萃取，萃取液过0.45 μm有机微孔滤膜待测.

1.4.3超声波提取称取红景天粉末10.00 g于三角瓶中加200 mL70%乙醇超声提取30 min，将提取液纯化：分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯除杂，然后用正丁醇萃取，萃取液过0.45 μm有机微孔滤膜待测.

1.4.4超声波辅助法单因素试验设计影响微波辅助提取红景天苷的主要因素有提取剂体积分数、提取剂pH值、料液比和提取时间等.本试验在料液比( g∶mL)1∶20，提取时间为30 min，提取剂pH为7的前提下，提取剂体积分数分别选取0、20%、40%、60%、80% 5个水平；在料液比1∶20，提取时间为30 min，提取剂体积分数为60%的前提下，提取剂pH值分别选取4、6、8、10、12 5个水平；在提取时间为30 min，提取剂体积分数为60%，提取剂pH为8的前提下，料液比分别选取1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28(g∶mL)5个水平；在料液比1∶20，提取剂体积分数为60%，提取剂pH为8的前提下，提取时间分别选取 25、40、 20、55、70、 85 min 5个水平；每组试验平行3次，计算红景天苷的提取率.(以上所有试验均在微波功率100 W，25 ℃下进行).

1.4.5红景天苷对照品溶液的配制试验所用标准对照质量液浓度为10 mg/1 000 mL.精密称取红景天苷对照品17.4 mg，用超纯水溶解并定容于10 mL的容量瓶中，作为对照品储备液.精确量取储备液2 mL用超纯水定容至100 mL容量瓶中，取上述溶液28.8 mL用超纯水定容至100 mL，即得10 mg/1 000 mL的标准样品溶液，为所用标准对照液.

1.4.6HPLC检测色谱条件：色谱柱为XDB-Cs、5 μm、4.6 150 mm C8柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-水(15∶85)线性梯度淋洗；流速1.0 mL/min，柱温35 ℃；波长275 nm；理论塔板数不低于2 000，检测器为二极管阵列.

1.4.7响应面分析试验在单因素试验的基础上，以乙醇体积分数、pH值、料液比、提取时间为4个因素，提取率为考察指标设计响应面分析试验.

2结果与分析

2.1红景天苷对照品最大吸收波长的测定

取对照品溶液，在200～400 nm进行紫外扫描，结果见图1.从图1可以看出，红景天苷在218 nm和274 nm处有最大吸收峰.但是274 nm处吸收峰值远小于218 nm处，对检测器的灵敏度要求很高，而195.8 nm处受甲醇和水的干扰很大故选择218 nm为红景天苷的检测波长.

图1　红景天苷标准品紫外吸收曲线Fig.1　Ultraviolet absorption curve ofsalidroside standard

2.2标曲准曲线的绘制

分别配制3、5、10、20、40(mg/100 mL)的红景天苷标液，过0.45 μm的无机滤膜，于高效液相色谱仪上检测，所得的5个标样的峰面积分别是131.4、164.2、331.2、627.2、1 306.6 mV·min.以峰面积为纵坐标，质量分数为横坐标(mg/100mL)绘制标准曲线如图2.

图2　红景天苷标准品标准曲线Fig.2　The standard curve of salidroside standard

3种方法所得红景天苷检测峰面积分别为1 185.4 mV·min(回流提取)、2 368.8 mV·min(索氏提取)、1 596.6 mV·min(超声波提取).根据所得线性方程计算提取液质量浓度分别为36.6 mg/100 mL(回流提取)、73.5 mg/100 mL(索氏提取)、49.4 mg/100 mL(回流提取).根据提取液的体积(回流提取所得体积为145 mL，索氏提取体积为191 mL，超声波提取体积为175 mL)可计算出3种方法的红景天提取率.

图3　回流提取检测结果Fig.3　Detection result of reflux extraction

图4　索氏提取检测结果Fig.4　Detection result of Soxhlet extraction

图5　超声波提取检测结果Fig.4　Detection result of ultrasonic extraction

2.3单因素试验

2.3.1乙醇体积分数对红景天苷提取率的影响由图6可知，红景天苷的提取率随着乙醇体积分数的增加而增大，当乙醇体积分数为60%时，提取率达到最高，为0.60%.

图6　乙醇体积分对提取率的影响Fig.6　Effect of ethanol contentrationof extraction rate

2.3.2提取剂pH值对红景天苷提取率的影响由图7可知，红景天苷的提取率随着pH值的增加而增大，当pH=8时，提取率达到最高，为0.47%.

图7　pH对提取率的影响Fig.7　Effect of pH on extraction rate

2.3.3料液比对红景天苷提取率的影响如图8所示，红景天苷的提取率随着料液比的增加而增大，当料液比为1∶20时，提取率达到最高，为0.49%.

图8　料液比对提取率的影响Fig.8　Effect of ratio of material to liquidon extraction rate

2.3.4提取时间对红景天苷提取率的影响本试验以15 min为梯度，随着超声时间的增加，提取率不断提高，到达70 min时红景天苷提取率最大，为0.51%.一般时间控制在1 h左右.

图9　提取时间对提取率的影响Fig.9　Effect of time on extraction rate

2.4响应面分析结果

单因素的最佳提取条件如表1所示.响应面试验分析如表2所示，采用Desing-Expert 7.0软件对表2数据进行多元回归拟合，获得对响应值—果胶产率的影响因子—乙醇体积分数(X1)、提取剂pH(X2)、料液比(X3)、提取时间(X4)的二次多项式回归模型，得到果胶产率的回归方程为:

R=0.79-0.020X1-0.041X2-0.018X3+0.011X4+ 0.050X1X2- 0.028X1X3+ 0.013X1X4+ 0.013X2X3- 0.015X2X4- 0.091X12- 0.15X22- 0.063X32- 0.11X42

表1　最佳单因素提取条件

表2　响应面设计因素与水平

利用Desing-Expert 7.0对表2数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面如图10所示.

从图10可以看出，在其中两个因素确定的情况下另两个因素总是呈现出先增大后减小的趋势，说明这两个因素曲线在三维模型图中的交叉点必然达到某个最大值，该最大值对应的R1值就是此刻条件下的最佳提取含量.

表3为响应面模型的方差分析表.从该表中看出，模型方差为0.25，均差为0.001 9，F值23.34，P值0.000 2，效果显著.失拟项F值1.42，P值0.396 1<0.5，不显著.说明该模型分析对试验分析有效.

从模型总体分析中得出一组最佳提取条件，为乙醇浓度57%，pH7.66，料液比1∶19，时间71 min.该条件下R1值达0.94%.因此采用最佳条件做一组超声波提取试验，结果如图11所示.

在最佳提取条件下测定提取液测定峰面积为1 596.6 mV·min，计算后提取率为0.89%.

图10　响应面优化交互作Fig.10　The optimization interaction of response surface

方差来源平方和自由度均方F值P>F模型0.25000140.001923.340.0002X10.0048010.004811.830.0001X20.0020010.00202.470.0042X30.0433010.04036.70.0021X40.0140810.00144.240.0033X1X20.0001010.00011.730.2076X1X30.0003010.00031.520.0482X1X40.0006310.00010.110.0074X2X30.0000010.00000.0110.465X2X40.0000010.00000.160.6983续表3方差来源平方和自由度均方F值P>FX120.0053010.005311.230.0083X220.0014010.00144.090.162X320.0026010.00468.480.034X420.0074010.00046.840.052残差0.08600150.0058失拟项比F值0.06900110.00631.420.3961绝对误差0.0180040.0044总离值0.3400028

图11　最佳提取条件下提取检测图Fig.11　The figure of extraction and detection under the optimum extraction conditions

3讨论与结论

通过回流提取、索氏提取和超声波提取3种方法对红景天苷的提取对比，索氏提取法的提取率较高，提取率为1.14%，超声波提取法的提取率次之，提取率为0.77%，回流提取法提取率相对最低，提取率为0.53%.通过超声波单因素试验，并结合响应面分析研究得出红景天苷的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数为57%、提取剂pH值为7.66、料液比为1∶19、提取时间为71 min.在此最佳条件下提取液测定峰面积为1 596.6 mV·min，计算后提取率为0.89%.该研究结果为有效利用红景天资源及其工业生产提供了科学依据.

由以上结论可以看出，虽然索氏提取法提取率高，但我们还是选择超声波提取法为最佳提取方法.一方面是因为索氏提取耗时长，需要的提取温度较高，可能破坏有效成分的结构组成，且冷凝过程要浪费大量的水.另一方面是因为超声波具有较强的穿透力，短时间内即可破坏植物的组织细胞壁，提高了提取植物中有效成分的效率，缩短多糖提取时间，减小料液比，能耗小，提取率也较高.综和以上两方面原因，本试验得出，红景天苷的最佳提取方法为超声波提取法.

乙醇回流提取法不仅提取率低，耗时长，浪费水，且提取出的有效成分杂质较多.故其不是最佳提取方法.

因为试验条件有限，所用超声波提取器无法调功率，故所有单因素试验均在100 W功率下进行.

提取剂pH是用4 mol/L硫酸和4 mol/L NaOH来调节的，所需确切pH值由pH计测定.

参考文献

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(责任编辑赵晓倩)

Extraction process of Salidroside fromRhodiolarosea

WANG Xing-fang1，LI Ying1，SONG Jin-guo2，XIAO Wen2

(1.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070,China；2.College of

Natural Science,Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070,China)

Abstract：To determine the optimum extraction process of Salidroside fromRhodiola.Aqueous ethanol refluxing,Soxhlet extraction and ultrasonic extraction method were used to extract Salidroside from Rhodiola selecting optimal extraction method by comprehensive analysis.To optimize the best extraction method,single-factor test was designed to research the impact of ethanol concentration，pH value of extraction solvent，extraction time and ratio of material to liquid on the extraction rate of Salidroside and designed response surface analysis test based on results of single factor to further determine the optimum extraction conditions.The results showed that ultrasonic extraction was the best extraction method,the optimum extraction conditions were: ethanol concentration 57%,pH7.66,ratio of material to liquid 1∶19,extraction time 71 minutes and the extraction rate of Salidroside was 0.89%.The results will provide the basis for effective use of rhodiola resources and industrial production .

Key words：Rhodiola;Salidroside;extraction process

收稿日期：2014-11-10；修回日期：2015-01-08

基金项目：2012年中医药行业科研专项甘肃省代表性区域中药资源保护利用(201207002-02).

通信作者：肖雯，女，教授，硕士生导师，主要从事化学教育、植物抗逆生理生态、内陆盐渍化防治方向研究.E-mail：xiaowen@gsau.edu.cn

中图分类号：R 284.2

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)06-0136-07