Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛生精小管的定位及分布特征

路琪中,袁莉刚,吕亚楠,周福来,沈岩尔,王亭亭

(甘肃农业大学动物医学院,甘肃 兰州　730070)



Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛生精小管的定位及分布特征

路琪中,袁莉刚,吕亚楠,周福来,沈岩尔,王亭亭

(甘肃农业大学动物医学院,甘肃 兰州730070)

摘要：采用H.E和Masson特殊染色以及免疫组织化学法结合形态计量学统计分析,对成年牦牛(5～7岁)生精小管中的Ⅳ型胶原蛋白进行定位，研究其分布特征.结果表明：睾丸生精上皮结构清晰,有4～8层细胞,胶原纤维分布于生精小管固有膜和间质血管壁上；免疫组织化学染色观察Ⅳ型胶原蛋白在sertoli细胞、各级生精细胞及精子上呈强阳性表达,血管内皮细胞有阳性表达,生精小管基膜及管周肌样细胞为弱阳性表达,而leydig细胞几乎无表达；Ⅳ型胶原蛋白的相对表达量在sertoli细胞及各级生精细胞显著高于在leydig细胞和管周肌样细胞中(P<0.05),但在固有膜和管周肌样细胞之间的相对表达量无显著差异(P>0.01).Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛睾丸中的分布特征与胶原纤维分布相一致,sertoli细胞和管周肌样细胞在合成及分泌Ⅳ型胶原蛋白中发挥作用.

关键词：成年牦牛；睾丸；Ⅳ型胶原蛋白；免疫组织化学染色法

第一作者：路琪中(1993-),男,本科生，研究方向为动物发育生物学.E-mail：1498647970@qq.com

哺乳动物睾丸实质组织包括生精小管和管周细胞间质部分,含有很多细胞因子及其受体,在诱导生精细胞形态学改变以及调节细胞间相互作用方面具有十分重要的意义[1].研究表明胶原蛋白、层粘连蛋白(laminin,LN)、制动素和蛋白多糖等是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分,它主要存在于动物组织中,约占哺乳动物体内蛋白质总量的25%～30%,Ⅳ型胶原蛋白(collagenⅣ)存在于所有器官的基膜中,形成结构网架,使其具有韧性和通透性[2].据研究报道,Ⅳ型胶原蛋白具有调控细胞迁移、增值、分化和代谢的功能[3].研究认为哺乳动物睾丸sertoli细胞和管周肌样细胞均能合成Ⅳ型胶原蛋白,参与构成基底膜,对大分子蛋白等物质具有选择性透性[4].

牦牛生活在气候寒冷、缺氧和低气压等生态环境下,其对环境有很强的适应能力.研究表明,高原低氧环境下睾丸组织形态学发生改变，其生精功能也会受到影响[5].Liao等[6]研究表明,缺氧对雄性牦牛生育能力的抑制不可忽视,睾丸局部血液循环中氧含量较低,可导致各种酶及蛋白降解能力降低,精子生成数量减少.研究表明,Ⅳ型胶原蛋白在牦牛犊牛sertoli细胞中呈强阳性表达,其在生精小管发育及基膜的构建等方面发挥重要作用[7].目前国内外对于成年牦牛睾丸胶原蛋白的定位研究尚未见报道.因此,本研究通过免疫组织化学技术观察成年牦牛生精小管Ⅳ型胶原蛋白的分布特点,分析其生理特征与发育微环境的关系,旨在为高原哺乳动物睾丸发育的适应性结构研究提供形态学参考.

1材料与方法

1.1试验动物

10、11月份在青海大通牧区通过外科去势手术采集成年牦牛(5～7岁)睾丸10对,取样固定.

1.2主要药品试剂

兔抗鼠Ⅳ型胶原蛋白多克隆抗体(bs-0806R,购自北京博奥森生物技术有限公司)；免疫组化染色试剂盒(SP-9001,由美国ZYMED生产,购自北京中杉金桥生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒(ZLI-9018,北京中杉金桥生物技术有限公司).

1.3试验方法

1.3.1组织样品制备和观察将组织样品切成1 cm×1 cm×0.6 cm大小,4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定,常规石蜡包埋,切片厚5 μm,苏木精-伊红(H.E)常规染色；Masson三色染色(亮绿),胶原纤维呈现蓝绿色,细胞核呈现灰黑或灰蓝色,红细胞呈红色.

1.3.2免疫组化染色采用免疫组化SP(streptavidin-perosidase)法进行染色,石蜡切片常规脱蜡,酒精梯度分化；30 g/L H2O2水溶液封闭过氧化物酶10 min,正常山羊血清白蛋白孵育15 min后；每张切片滴加50 μL兔多克隆抗鼠Col Ⅳ-IgG (稀释度1∶400),37 ℃孵育2 h,PBS振洗后每张切片滴加50 μL生物素标记山羊抗兔IgG工作液,后加50 μL辣根酶标记链霉卵白素工作液,37 ℃孵育滴加新鲜配制DAB显色液,常规脱水透明、封片.阴性对照以PBS替代兔源一抗进行染色.

1.4数据统计分析

2结果与分析

2.1睾丸组织显微结构特征

光镜下,性成熟牦牛睾丸组织的生精小管生精上皮(spermatogenic epithelium)由4～8层生精细胞及sertoli细胞构成,大量成熟的精子明显分布于腔面,胞核呈长索形的管周肌样细胞围绕于生精小管固有膜外周,leydig细胞成簇分布于间质组织中(图1-A,1-B)；间质组织内胶原纤维分布明显,尤以生精小管固有膜较为丰富(图1-C,1-D).

2.2Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛睾丸组织中的分布

免疫组织化学结果显示,睾丸生精小管基膜、sertoli细胞、各级生精细胞和精子中均显示有Ⅳ型胶原蛋白阳性表达,其中sertoli细胞、各级生精细胞及精子呈强阳性表达(图2-A,2-B),血管内皮细胞有阳性表达,生精小管基膜及肌样细胞为弱阳性表达,而leydig 细胞几乎无表达(图2-C),阴性对照无表达(图2-D).

A,B:成年牦牛睾丸组织，HE染色,A标尺示200 μm,B标尺示20 μm；C,D：成年牦牛睾丸组织，Masson染色,C标尺示100 μm,D标尺示20 μm;ST:生精小管；CF：胶原纤维；SA：小血管.图1　成年牦牛睾丸组织H.E染色及Masson染色Fig.1　H.E and Masson staning in adult yak testis

A:Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛睾丸组织中的表达，免疫组化染色,标尺示100 μm；B：Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛睾丸组织中的表达，免疫组化染色,标尺示20 μm；C： Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛睾丸组织中的表达，免疫组化染色,标尺示10 μm；D：免疫组化染色阴性对照，标尺示20 μm；▲：leydig细胞；↓：sertoli 细胞 ；：肌样细胞；★：生精细胞；ST：生精小管；SA：小血管.图2　Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛睾丸免疫组织化学染色Fig.2　Immunohistochemical staning of collagen Ⅳ in adult yak testis

2.3Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛睾丸组织相对表达量分析

Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛睾丸组织免疫组化显示,其在sertoli细胞的相对表达量为(7.96±0.65),在生精小管固有膜的相对表达量为(0.51±0.21)(P<0.01)，在管周肌样细胞的相对表达量为(0.16±0.11)(P<0.05)；leydig细胞的相对表达量(0.08±0.05)显著低于固有膜(0.15±0.21)和管周肌样细胞(0.16±0.11)的相对表达量(P<0.05),但是在固有膜和管周肌样细胞之间的表达无显著差异(P>0.05)(图2-A,2-C,表1,图3).阴性对照无表达(图2-D).

表1　Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛睾丸的相对表达(n=30)

与sertoli细胞相对表达量相比较,*表示差异显著(P<0.05).

3讨论与结论

睾丸生精小管由复杂的生精上皮和界线清楚的基膜构成.生精小管间是富含淋巴管、血管、神经和leydig细胞的疏松结缔组织.生精上皮主要由生精细胞和sertoli细胞组成,不同发育阶段的生精细胞可排列成4～8层,逐步发育形成精子[8].高寒低氧地区,公牦牛在3 岁进入繁殖群配种期,配种年龄为4～8 岁,生殖能力较强,8、9岁以后逐渐老龄化,繁殖能力迅速减退[9].朱俊峰等[10]研究表明,3岁牦牛生精小管密集、发育充分,外直径增加明显,上皮细胞层数达到最大值.睾丸间质结缔组织含量的增加会引起睾丸组织纤维化,影响睾丸leydig细胞分泌产物的输送,进而影响其对睾丸生精功能的调控[11].本研究中5～7岁性成熟牦牛睾丸生精小管结构清楚,复层上皮分层明显,表明其发育良好,间质结缔组织含量对睾丸功能无明显影响.

睾丸sertoli细胞和管周肌样细胞在产生和形成细胞外基质(ECM)时互相合作且均能合成Ⅳ型胶原蛋白,参与形成固有膜[12-14].研究报道,Ⅳ型胶原蛋白和LN沿上皮基膜和围绕管周肌样细胞、sertoli细胞分布,LN及Ⅳ型胶原蛋白在管周肌样细胞发育时出现,且在sertoli细胞分化以及维持分化的各个阶段发挥功能[15].本研究中Ⅳ型胶原蛋白在生精小管基膜和肌样细胞均有表达,在sertoli相对表达量为(7.96±0.65),为强阳性表达；管周肌样细胞的相对表达量为(0.16±0.11),与sertoli细胞相比差异显著.Scott等[4]研究表明，Ⅳ型胶原蛋白在犬的生精小管基膜呈阳性表达,表明sertoli细胞和管周肌样细胞相互合作在合成及分泌Ⅳ型胶原蛋白中发挥作用.此结果与本研究结果相一致,提示牦牛睾丸sertoli细胞和管周肌样细胞与合成Ⅳ型胶原蛋白密切相关.

杨芳等[16]研究表明,Ⅳ型胶原蛋白在正常细胞的发育、分化、粘附、运动等生理功能中发挥重要作用.杨政[17]研究发现,Ⅳ型胶原蛋白可由活化的肾小球系膜细胞、内皮细胞、上皮细胞、肾小管上皮细胞等合成和分泌,参与肾脏生理功能的调节.研究表明,Ⅳ型胶原蛋白在牦牛犊牛睾丸间质内强阳性表达,在生殖母细胞有丝分裂阶段无表达；提示Ⅳ型胶原蛋白可以促进生殖母细胞从管壁移向管腔，但并不参与其分化与成熟过程[7].本研究中Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛睾丸组织各级生精细胞及精子呈强阳性表达,与Glattauer等[18]在牛睾丸组织中Ⅳ型胶原蛋白主要存在于基膜及生精细胞的结果相一致，其认为牛生精细胞亦可产生Ⅳ型胶原蛋白，但是关于牦牛生精细胞是否可产生Ⅳ型胶原蛋白还有待于进一步研究.

因此,Ⅳ型胶原蛋白在成年牦牛睾丸中的分布特征与胶原纤维分布相一致,sertoli细胞和管周肌样细胞在合成及分泌Ⅳ型胶原蛋白中发挥作用.

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(责任编辑胡文忠)

Distribution characteristic of collagen Ⅳ in

adult yak testis

LU Qi-zhong,YUAN Li-gang,LYU Ya-nan,ZHOU Fu-lai,SHEN Yan-er,WANG Ting-ting

(College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：In order to clearly understand the distribution of collagen Ⅳ(Col Ⅳ)in adult yak testis (5～7 years old),this report provided a detailed description about the distribution of collagen Ⅳ by the methods of paraffin section stained with hematoxylin and eosin,Masson's trichrome and immunohistochemistry.The results showed that the morphological structure was obvious clear at the light microscope,there were 4～8 layers cell in spermatogenic epithelium,and abundant collagen fiber in the adult yak seminiferous basement and blood capillary.The strong immunoreactivity of collagen Ⅳ was seen in Sertoli cells,spermatogenic cells,spermatozoa and vascular endothelial cells,collagen Ⅳ were weakly present throughout the basement membranes (BM) and peritubular myoid cells in seminiferous tubule,but no expression in leydig cells.The statistical dates indicated that the relative expression of collagen Ⅳ in Sertoli cells and spermatogenic cells was significantly higher than leydig cells and peritubular myoid cells (P<0.05),but collagen Ⅳ were weakly present expression between the BM and peritubular myoid cells (P>0.01).In conclusion,the distribution of collagen Ⅳ was consistent with collagen fiber in adult yak testis.The Sertoli cells and peritubular myoid cells were the main causes for the secretion of collagen Ⅳ,could serve as a meaningful index for the further research of the yak testis plateau adaption function.

Key words：adult yak;testis;collagen Ⅳ;immunohistochemistry

收稿日期：2014-12-08；修回日期：2015-03-16

基金项目：国家自然科学基金项目(31160488)；甘肃农业大学大学生科研训练项目(20140317).

通信作者：袁莉刚(1974-),女,博士,教授,研究方向为动物解剖学、组织胚胎学及动物发育生物学.E-mail：yuan2918@126.com

中图分类号：S852.16+2

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)06-0001-05