HPLC法测定芸薹子中芥子碱硫氰酸盐含量

孔 燕，张 璐，房克慧

(扬州市药品检验所，扬州 225009)

1.芥子碱硫氰酸盐



HPLC法测定芸薹子中芥子碱硫氰酸盐含量

孔 燕，张 璐，房克慧

(扬州市药品检验所，扬州 225009)

目的：建立高效液相色谱法研究芸薹子药材的质量控制标准。方法：采用Apollo C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)为填充柱，以乙腈-3%冰醋酸(15∶85)为流动相，流速为1.0 ml/min，柱温为25 ℃，检测波长为330 nm，进样量为10 μl，测定芸薹子药材中芥子碱硫氰酸盐的含量。结果：对8批芸薹子药材进行试验，芥子碱硫氰酸盐在26.66～93.31 μg/ml的范围内呈现良好的线性关系(r=0.999 9,n=6)，平均回收率为101.61%，RSD为0.6%。结论：建立的HPLC方法简便、准确可信，可作为芸薹子药材的质量控制标准。

芸薹子，芥子碱硫氰酸盐，高效液相色谱法，质量控制标准

芸薹子是十字花科芸薹属植物油菜(BrassicaerapaL)的种子[1]，为江苏省地方药材，具有行血、破气、消肿、散结的功效，常用于产后血滞腹痛、血痢、肿毒、痔漏。芸薹子药材收载于《江苏省中药材标准》(1989版)，其标准年代久远，其中并无含量测定的项目，文献也无相关报道，为了有效地控制芸薹子药材的质量，笔者考查了芸薹子中的活性成分，最终决定采用高效液相色谱法测定其中芥子碱硫氰酸盐的含量。芥子碱硫氰酸盐是芥子碱在芸薹子中的存在形式，为芸薹子的主要成分之一。芥子碱为季胺类生物碱，属于胆碱衍生物，是芥子酸与胆碱形成的酯。近年来发现芥子碱具有降血压、抗衰老、抗辐射、抗雄激素、消炎止泻以及抑制乙酰胆酯酶等多方面的药理作用[2-5]。芥子碱在自然界中只有极少一部分是以单体的形式存在，通常与有机酸结合成盐而存在，或以糖苷、有机酸酯和酰胺的形式存在，而在常用十字花科药用植物中以芥子碱硫氰酸盐的形式存在最为广泛。因此，测定芸薹子中芥子碱硫氰酸盐的含量可用于该药材的质量控制研究。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪，G1316A 1260 TCC二极管阵列检测器， Mettler Toledo MS204S 电子天平； 芥子碱硫氰酸盐对照品(中国药品生物制品检定所，批号111702-200501)； 乙腈为色谱纯，甲醇为分析纯，水为纯化水，冰醋酸为分析纯； 芸薹子药材样品经南京中山植物研究所徐增莱教授鉴定，其样品信息见表1。

表1 芸薹子来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件 以Apollo C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)为填充剂；以乙腈-3%冰醋酸(15∶85)为流动相；流速为1.0 ml/min；柱温为25 ℃；检测波长为330 nm；进样量为10 μl。理论板数按芥子碱峰计算应不低于3 000。供试品溶液中对照品峰与其临近峰分离度>1.5。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取芥子碱硫氰酸盐对照品13.33 mg，置100 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取芸薹子粉末(过二号筛)适量，精密称取0.5 g，置50 ml量瓶中，加50%甲醇溶液35 ml，超声处理45 min，加50%甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，即得。分别精密吸取对照品和供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，色谱图见图1。

1.芥子碱硫氰酸盐

图1 对照品(A)供试品(B)HPLC色谱图

2.3 线性关系考查 精密量取储备液2、3、4、5、6和7 ml，分别置10 ml量瓶中，以50%甲醇稀释至刻度，制成浓度为26.66、39.99、53.32、66.65、79.98和93.31 μg/ml的对照品溶液，精密量取对照品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以样品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，计算回归方程为：Y=30.471X-4.567 6(r= 0.999 9)，结果表明芥子碱硫氰酸盐对照品在26.66～93.31 μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验 精密吸取53.32 μg/ml的对照品溶液10 μl，按“2.1”项下色谱条件连续测定6次，记录色谱峰面积，计算RSD为0.3%。表明仪器的精密度良好。

2.5 稳定性试验 取同一样品溶液，分别于0、2、4、6、8和12 h进样10 μl，按“2.1”项下色谱条件测定，记录各峰面积，结果芥子碱硫氰酸盐峰面积的RSD为1.3%(n=6)。表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.6 重复性试验 取4号样品6份，每份0.5 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。结果芥子碱硫氰酸盐含量的RSD为0.9%，表明方法的重复性较好。

2.7 最低检测限和定量限 将对照品储备液用甲醇进行多次等倍稀释，信噪比/N为10时，芥子碱硫氰酸盐最低定量限为0.319 9 μg/ml。信噪比/N为3时，芥子碱硫氰酸盐最低检测限为0.096 0 μg/ml。

2.8 加样回收率试验 取4号样品9份，每份0.12 g，精密称定，分别精密加入浓度为133.3 μg/ml的对照品储备液5、6和7 ml，加50%甲醇适量，超声处理45 min，定容至25 ml，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，即得。按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，芥子碱硫氰酸盐平均回收率为101.61%，RSD为0.6%。结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.9 含量测定 分取上述8批样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算含量，结果见表3。8批样品中芥子碱硫氰酸盐的含量，按干燥品计平均值为0.450%，最低值为0.266%，最高值为0.750%。从试验结果可见含量差异较大，自采药材芥子碱硫氰酸盐的含量均较高，自购饮片的含量均较低。

表3 含量测定结果

3 讨论

3.1 提取溶剂的考查 以体积分数50%、70%、90%和纯甲醇作为提取溶剂，结果50%甲醇提取效率最高，故实验采用50%甲醇作为提取溶剂。

3.2 提取方式的考查 比较超声提取和回流提取效果，2种方式提取率接近，考虑到超声提取简便，故实验采用超声提取方式。

3.3 超声时间的考查 比较超声提取15、30、45和60 min的提取率，超声处理45 min即可提取完全，因此实验超声时间定为45 min。

3.4 含量测定的结果 《中国药典》2010年版[6]收载芥子和莱菔子的质量标准中均以芥子碱作为含量测定的指标性成分，两种药材均来源于十字花科植物。近年来研究发现，芥子碱具有显著的抗氧化、抗辐射、抗衰老、降血压、抗炎、抗腹泻和抗雄激素等多种生物活性[7]。芥子碱在自然界中只有极少一部分是以单体的形式存在，以芥子碱硫氰酸盐的形式存在最为广泛。故实验选择以芥子碱硫氰酸盐作对照品，参照《中国药典》方法制定芸薹子的含量测定方法，操作简单，结果准确，重复性好，方法经验证可行，可用于芸薹子药材的定量分析和质量控制。

1 南京中医药大学.中药大辞典[].第2版.上海：上海科学技术出版社，2006：1464

2 邢军，苑艳霞，冯宝民. 五种十字花科植物中芥子碱的有效提取和高效液相色谱定量分析[J].分析科学学报，2012，28(4)：523

3 Zhang M F, Shen Y Q. Antidiarrheal and anti-inflammatory effevts of sinapine[J].Pharmacol Clin Chin Mater Med，1996(1)：29-31

4 Li J, Shi Z, Zhao L J,etal. Effect of sinapine hydrogen sulfate on blood pressure and heart rate of spontaneous hypertension rat [J]. Jilin J Tradit Chin Med，2002，22(6)：55-56

5 Wu G X, Lin Y X,Ou M R. Anti-androgenic effect of sinapine[J]. China J Tradit Chin Med Pharm，2003，18(3)：142-144

6 中国药典[]．一部. 2010：149，255

7 柯木根，吴国欣，林燕妮，等.芥子碱的研究概况[J].中草药，2007，38(9)：1436

Determination of sinapine cyanide sulfonate in brassicae rapae semen by HPLC

Kong yan, Zhang lu, Fang Kehui

(Yangzhou Institute for Drug Control, Yangzhou 225009)

Objective: To establish an HPLC method for quantitative determination of sinapine cyanide sulfonate in brassicae rapae semen. Methods: The Apollo C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)was used at 25 ℃ with a mobile phase cmposed of acetonitrile-3% glacial acetic acid(15∶85) at 1.0 ml/min. The detection wave length was set at 330 nm. The injection size was 10 μl. Results: Eight batches of samples were analyzed with a good linearity (r=0.999 9,n=6) with the concentrations of sinapine cyanide sulfonate lying within 26.66～93.31 μg/ml， the average recovery was 101.61%(RSD was 0.6%). Conclusion: The HPLC method was simple and reliable and can be used for quantitative measuring the contents of sinapine cyanide sulfonate in the quality control of brassicae rapae semen.

brassicae rapae semen，sinapine cyanide sulfonate，HPLC，quality control standard

2015-05-20

R927.1

A

1006-5687(2015)05-0015-03