固相萃取高效液相色谱法测定六经头痛片中马兜铃酸Ⅰ的含量

黄可婧，祝小静

(天津市药品检验所，天津 300070)

1．马兜铃酸Ⅰ



黄可婧，祝小静

(天津市药品检验所，天津 300070)

目的：建立六经头痛片中马兜铃酸Ⅰ的限量检查法。方法: 通过提取、固相萃取对制剂中马兜铃酸Ⅰ进行提取纯化，应用高效液相色谱法对其进行检测。色谱条件: 采用Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈-1%冰醋酸(38∶62), 检测波长为250 nm。结果：马兜铃酸Ⅰ在0.199 6～0.997 9 μg/ml范围内线性关系良好(r=0.999 7)。检测限为0.997 9 ng、定量限为1.996 ng；平均回收率为99.18%，RSD为1.47%。结论: 所建立的方法简便快捷，结果准确可靠，可作为控制六经头痛片安全性的检测方法。

六经头痛片，马兜铃酸Ⅰ，固相萃取-高效液相色谱，毒性成分限量检查

六经头痛片为国家中药保护品种，是由白芷、辛夷、藁本、细辛等9味中药加工制成的片剂，具有疏风活络、止痛利窍的功效，用于全头痛、偏头痛及局部头痛。因制剂中细辛含有马兜铃酸[1-5]，马兜铃酸可引起肾脏毒性，根据国家中药品种保护审评委员会的改进意见与有关要求，在原标准的基础上增加了马兜铃酸Ⅰ的限量检查方法。

1 仪器与试药

SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，LC solution工作站。马兜铃酸Ⅰ对照品(中国药品生物制品检定研究院，纯度为98.8%，批号110746-201108)；六经头痛片(天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂，批号A12352、A2353、A12354、0811238、0901246)；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Phenomenex C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈-1%冰醋酸(38∶62)为流动相，柱温:40 ℃，流速：1.0 ml/min，进样量：10 μl，检测波长为250 nm。理论板数按马兜铃酸Ⅰ峰计算应不低于5 000[6]。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取马兜铃酸Ⅰ对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含马兜铃酸Ⅰ 0.2 μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取样品适量，除去包衣，研细，取细粉约3 g，精密称定，精密加入甲醇25 ml，超声处理40 min后，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml，加至依次用甲醇、水、甲醇各3 ml预洗的strata X-AW 33 μm(Phenomenex，60 mg/3 ml)固相萃取柱上，依次用水、甲醇洗涤至洗脱液无色，弃去洗脱液，再用甲酸甲醇溶液(25→100)洗脱至5 ml量瓶中，洗脱至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 取处方1/100处方量(除细辛外)，按制法及供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液，即得。

2.3 系统适用性试验 分别精密吸取对照品、阴性样品和供试品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件分析。色谱图见图1，可见样品中其他成分对测定无干扰。理论板数按马兜铃酸Ⅰ峰计算在10 000 以上，马兜铃酸Ⅰ 峰与相邻的峰分离良好。

2.4 线性关系考查 取马兜铃酸Ⅰ对照品适量，加甲醇制成每1 ml分别含0.997 9、0.499 0、0.399 2、0.299 4和0.199 6 μg的系列对照品溶液，吸取10 μl，按“2.1”项下色谱条件测定马兜铃酸Ⅰ的峰面积，以对照品溶液(μg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得方程：Y=60.99X+0.650(r=0.999 9)，结果表明，马兜铃酸Ⅰ在0.199 6～0.997 9 μg/ml范围内线性关系良好。

2.5 检出限及定量限的测定 取对照品溶液(0.199 6 μg/ml)，分别精密吸取5和10 μl，按“2.1”项下色谱条件分析，记录色谱图，结果表明进样量为5 μl时，马兜铃酸Ⅰ峰信噪比(/N)为5.5；进样量为10 μl时，马兜铃酸Ⅰ峰信噪比(/N)为14.8，表明该色谱条件下马兜铃酸Ⅰ的检出限为0.997 9 ng、定量限为1.996 ng。

2.6 精密度试验 取“回收率试验”中“回收-1”供试品，按“2.1”项下色谱条件分析，连续进样6次，测定马兜铃酸Ⅰ峰面积，测得峰面积平均值为13.33，RSD为0.88%，符合要求。

2.7 稳定性试验 取“回收率试验”中“回收-1”供试品，按“2.1”项下色谱条件分析，分别在0、4、8、12、18和24 h测定，测得马兜铃酸Ⅰ峰面积值的RSD为1.77%，符合要求。

1．马兜铃酸Ⅰ

图1 对照品(A)

阴性样品(B)供试品(C)HPLC色谱图

2.8 重复性试验 取同一批号(A12353)样品，除去包衣，研细，取约3 g(共6份)，精密称定，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“2.1”项下色谱条件分析，结果样品中未检出马兜铃酸Ⅰ。

2.9 加样回收率试验 取同一批号(A12353)样品，除去包衣，研细，取约3 g(共6份)，精密称定，至锥形瓶中，分别精密加入马兜铃酸Ⅰ对照品溶液(0.199 6 μg/ml)25 ml，再按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，制得供回收率用供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，计算回收率。结果平均回收率为99.18%， RSD为1.47%，符合规定。结果见表1。

表1 马兜铃酸加样回收率试验结果

2.10 药材及样品测定 取细辛药材中粉0.5 g，精密称定，以下同“2.2.2”项下供试品制备方法操作，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果药材中未检出马兜铃酸Ⅰ。另取该品5个批号的样品，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“2.1”项下色谱条件测定样品中马兜铃酸Ⅰ含量，结果5批样品中均未检出马兜铃酸Ⅰ，见表2。

表2 样品含量测定结果(n=2)

3 讨论

3.1 检测波长的确定 实验中使用二极管阵列检测器测定马兜铃酸Ⅰ的紫外光谱图，结果马兜铃酸I 在250、321和394 nm 处有吸收，其中250 nm 为最大吸收波长，故选择检测波长为250 nm[6]。

3.2 流动相的选择 参照有关文献，分别试验了甲醇-1%冰醋酸(65∶35)、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠(含磷酸1 ml/L)(37∶63)、乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱以及乙腈-1%冰醋酸不同比例，对流动相进行了考查，结果确定乙腈-1%冰醋酸(38∶62)作为本实验的流动相。

3.3 提取方法的选择 根据文献报道[7-9]，将样品采取甲醇加热回流提取，提取液蒸干，碱化，氯仿去除杂质后，将提取液酸化，用氯仿提取，所制得的供试品溶液仍杂质较多，未能将样品杂质峰与马兜铃酸色谱峰有效分离。并且马兜铃酸在样品处方中最大理论限量值甚微(约1.5 μg/g)，采取强酸强碱处理后，处方中与马兜铃酸结构类似的组分也许会相互转化，测定结果不能反映马兜铃酸在样品中的真实存在状态。本实验参照文献[10,11]，将样品的甲醇提取溶液，通过预洗并活化的strata-AW33u(Phenomenex，60 mg/3 ml)固相萃取柱，对目标物进行有效富集，然后用水、甲醇去除碱性杂质，再用甲酸甲醇溶液(25→100)洗脱目标物，从而达到富集净化的效果。

3.4 上样量及洗脱溶剂的选择 试验中对固相萃取柱的承载量、洗脱剂的酸度、洗脱剂的用量均进行了详细考查，最终选定文中规定的上样量及洗脱剂。

3.5 粗放度考查 分别使用Agilent 1100高效液相色谱仪(DAD)、岛津LC-20AD高效液相色谱仪(DAD)；Phenomenex-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱、Agilent-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱，结果表明：本实验建立的方法，采取不同色谱柱及仪器均能将样品中马兜铃酸Ⅰ与杂质有效分离。

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5 杜晓曦,周跃华,路金才,等.RP-HPLC法测定马兜铃酸含量方法的优化[J].中国中医药信息杂志,2007,14(7):47-49

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Huang Kejing,Zhu Xiaojing

(Tianjin Institute for Drug Control,Tianjin 300070)

Objective： To establish a method for determination the content limit of aristolochic acidⅠin Liujingtoutong tablet．Methods: Aristolochic acidⅠwas extracted from samples and purified by SPE.The contents of aristolochic acidⅠwas determined by an HPLC method with a phenomenex ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) column as stationary phase and a solution of acetonitrile-1% glacial acetic acid (38∶62)as mobile phase．The flow rate of the solution was 1.0 ml/min and the detection wavelength was set up at 250 nm. Results: There existed a good linear relationship between the peak area and the aristolochic acidⅠlevel when the levels of aristolochic acidⅠfall within the range of 0.199 6～0.997 9 μg/ml (The coefficient was 0.999 7).The detection limit and quantitation limit of aristolochic acidⅠin Liujingtoutong tablet were 0.997 9 ng and 1.996 ng, respectively. The average recovery(n=6) was 99.18%. Conclusion: The developed method is simple, accurate, reproducible, and can be used for the inspection of Liujingtoutong tablet．

Liujingtoutong tablet，aristolochic acid Ⅰ，SPE-HPLC，toxic ingredients limit test

2015-05-05

R927.2

A

1006-5687(2015)05-0009-03