4种东北食用菌内生菌的分离和纯化

范冬茹，张德岩，高智涛，王丹丽

(伊春林业科学院，黑龙江伊春153000)

4种东北食用菌内生菌的分离和纯化

范冬茹，张德岩，高智涛，王丹丽

(伊春林业科学院，黑龙江伊春153000)

从黑木耳、猴头菇、元蘑、榛蘑中分离内生菌，共得到内生真菌7株，内生细菌13株，其中革兰氏阴性菌7株，革兰氏阳性菌6株。猴头菇未分离出内生菌。研磨法为最适分离方法。NB培养基上分离出的内生菌较多，而用来分离内生真菌的PDA培养基仅分离出2株内生真菌，表明其营养成分不适于内生真菌的生长。

食用菌；内生菌；研磨法

从植物中分离内生菌是获得新的天然产物及开发新药的潜在资源，对植物内生菌的研究，具有重大的意义和开发价值。近年来，从蔬菜、花卉、药用植物等多种植物中分离到了大量内生菌，但在现有的报道中，对食用菌内生菌的研究较少。本实验以元蘑、榛蘑、猴头菇和伊春地区产量丰富的黑木耳为研究对象，分离和培养内生菌，开发新的微生物资源。

1 实验材料与方法

1.1 材料

黑木耳、猴头菇采摘于乌马河区为人工栽培种。元蘑、榛蘑采摘于红星区为野生生长菌株。实验对象要求为无霉烂、虫蛀、新鲜的子实体，其中黑木耳应选取背部无筋脉的厚实耳片。

1.2 培养基

用牛肉膏蛋白胨培养基(NB)分离、培养内生细菌；用葡萄糖马铃薯培养基(PDA)分离、培养内生真菌。培养基采用湿热灭菌法灭菌，高压蒸汽灭菌器121℃，维持20min。

1.3 方法

本实验将子实体灭菌之后采用组织分离法、研磨法、印迹法3种方法分离内分菌。在内生菌分离过程中，同时设置超净工作台无菌状态检测、漂洗液检验法、组织印迹法3种对照处理，以确保准确分离食用菌内生菌。具体操作方法如下：

1.3.1 子实体灭菌。在内生菌分离之前，在超净工作台内不同位置放置5个敞开盖子的PDA培养基，做超净工作台无菌状态检测。取新鲜的食用菌，无菌水冲洗5min，滤纸吸干表面水分后，用无菌水冲洗2次，75%乙醇浸泡3min，用无菌水冲洗3次，再用3%NaClO浸泡3min，用无菌水冲洗4次。将处理过的子实体压入PDA培养基中，使子实体与PDA培养基接触20min，移去子实体，做组织印迹法对照。把最后一遍漂洗子实体的无菌水，涂布于PDA培养基上，做漂洗液检验法对照。所有对照平板经28℃培养7天后，不得检出任何杂菌。

1.3.2 内生菌分离

1.3.2.1 印迹法：用无菌解剖刀将灭菌后的食用菌表皮去掉，将内部组织切割成0.5cm的小块，接于NB和PDA培养基上，并用镊子稍稍用力按压，然后将组织块取出。

1.3.2.2 组织分离法：将取出的组织快接于NB和PDA培养基上。

1.3.3.3 研磨法：另取组织块转入研钵中，加入适量灭菌过的石英砂和无菌水进行研磨，静止一段时间后，取上清液在NB和PDA上涂布。

每种方法3个平行。NB培养基于37℃恒温培养24h，PDA培养基于28℃恒温培养72h。纯化，斜面保存菌种。

1.4 统计与鉴别

比较不同分离方法对食用菌内生菌的分离效果。观察内生菌的菌落形态，通过革兰氏染色对分离到的内生细菌形态进行观察、鉴别。

2 结果与分析

2.1 不同分离方法对食用菌内生菌的分离情况

本实验用3种方法对黑木耳、猴头菇、元磨、榛蘑4种食用菌的内生菌进行分离。具体内生菌的分离数量见表1。

表1 不同分离方法对4种食用菌内生菌的分离结果

注：“-”表示未分离到食用菌内生菌

由表1可以看出，研磨法分离得到15株内生菌，组织分离法得到4株内生菌，印迹法分离得到1株内生菌，研磨法的分离效果最好。同时可以看出从榛蘑中分离出的内生菌数量最多，元磨、黑木耳次之。而猴头中并未得到内生菌，可能因其子实体被菌刺覆盖，消毒液沿菌刺进入子实体内部，而影响内生菌的分离。

2.2 不同培养基对食用菌内生菌的分离情况

NB培养基和PDA培养基分离内生细菌和内生真菌的情况见表2。

表2 不同培养基对4种食用菌内生菌的分离结果

由表2可以看出，NB培养基对内生菌的分离效果较好，分离出内生真菌5株，内生细菌9株。PDA培养基分离得到2株内生真菌，4株内生细菌。本次实验中共分离得到7株内生真菌，13株内

生细菌。

2.3 内生细菌的菌落特征及细胞形态

本次实验对内生细菌的菌落特征进行描述，并通过革兰氏染色在显微镜下进行观察，详见表3。

表3 内生细菌菌落特征和细胞形态

3 结论

植物内生菌能产生许多生物活性物质，往往具有抑制病原菌、协助宿主抵抗病原菌和促进宿主植物生长的作用。本实验对黑木耳、猴头菇、元蘑、榛蘑的内生菌进行初步分离，共得到内生真菌7株，内生细菌13株，其中革兰氏阴性菌7株，革兰氏阳性菌6株。猴头菇未分离出内生菌，可能是培养基不适或消毒液浓度过高的原因。3种分离内生菌的方法中，研磨法能使内生菌最大可能地释放出来，分离出的内生菌数量最多，为最适分离方法。NB培养基上分离出的内生菌较多，而用来分离内生真菌的PDA培养基仅分离出2株内生真菌，可能是其营养成分不适于内生真菌的生长。

内生细菌菌数显微镜下观察图

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[2]张敏星,张灵枝,周游,等. 茶树内生菌的分离和纯化[J].中国茶业，2011(12):12-13.

[3]刘丽娟，贾金如，王洪伟. 紫丁香内生菌分离与培养[J].农村经济与科技，2014(10):39-40.

2015-08-03

范冬茹(1987-)，女，助理工程师，主要从事食用菌研究工作，E-mail:124950629@qq.com。

S759.81

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.05.013