5-氮杂-2′-脱氧胞苷诱导肝癌细胞株SLIT2基因去甲基化的实验研究

李培坤 耿小平

5-氮杂-2′-脱氧胞苷诱导肝癌细胞株SLIT2基因去甲基化的实验研究

李培坤 耿小平

目的 观察肝细胞癌(HCC)细胞株SUN449、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B及epG2中SLIT2基因在5-Aza-CdR作用后，其启动子区甲基化状态及表达的变化，探讨HCC细胞株中SLIT2基因调控规律及甲基化调节抑制剂5-Aza-CdR对SLIT2基因转录的影响。方法对上述HCC细胞株体外培养，MSP法检测HCC细胞株中SLIT2启动子相关区域的甲基化状况。应用10 mmol/L浓度的5-Aza-CdR处理体外培养的5种HCC细胞后，MSP法检测用药前后细胞中SLIT2基因的甲基化状态，RT-PCR法检测用药前后细胞中SLIT2 mRNA的变化。结果SLIT2基因在各细胞株中启动子区呈异常高甲基化状态，mRNA低表达。经过5-Aza-CdR 处理后，SLIT2 基因启动子区呈显著去甲基化状态，其mRNA表达增强。结论启动子区异常甲基化是HCC细胞SLIT2基因失活的主要原因之一，去甲基化制剂5-Aza-CdR 能逆转SLIT2 基因甲基化状态, 从而调控SLIT2 基因表达。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷；肝细胞癌；SLIT2基因；DNA甲基化

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC) 为起源于肝细胞的恶性肿瘤，其恶性度高，缺乏较有效的治疗手段，术后复发和肝内转移普遍，在恶性肿瘤中，HCC发病率位列第5，病死率位列第3[1]。近年来，表观遗传学改变与HCC发生、发展的关系逐步被揭开，目前认为抑癌相关基因启动子DNA碱基异常甲基化修饰导致其表达失活在HCC发生发展过程中起重要作用，本研究小组前期在HCC组织标本和HCC细胞株中对多种基因进行了甲基化检测，筛选出甲基化率较高的SLIT2等基因[2]，本文拟在前期研究基础上，应用甲基化特异PCR技术(methylation-specific PCP，MSP)，探讨去甲基化制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-CdR)对SUN449、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B和HepG2 5种HCC细胞株中SLIT2基因异常高甲基化的逆转作用，为HCC的去甲基化治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 所用HCC细胞株系香港中文大学惠赠并于我实验中心留存，试剂5-Aza-CdR购自Sigma公司，DNA提取试剂盒购于Qiagen公司；提取全细胞RNA Trizol试剂为Invitrogen公司产品，DMEM细胞培养基购自Hyclone公司；DNA提取并甲基化修饰试剂盒为GEPIGENTEK公司产品；逆转录PCR试剂盒、Taq酶和dNTP购自TaKaRa公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HCC细胞培养 各细胞株在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃中5%CO2的条件下培养，培养至细胞处于对数生长期后，活细胞计数比例大于95%时用于实验。在含10 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中待饥饿培养24 h后，在细胞培养瓶中加入含有10 mmol/L 5-Aza-CdR的细胞培养液，培养后第1、3天换取同样含药浓度的培养液继续培养，培养至第5天收集细胞用于实验。设未加药物培养液培养的细胞作为对照组。

1.2.2 MSP法检测各细胞株中SLIT2启动子甲基化状态 各细胞株加入含5-Aza-CdR培养液作用5 d后，分别收集细胞，提取各细胞株基因组DNA，细胞基因组DNA提取及甲基化修饰：按照QIAmp DNA Mini and Blood Mini Kit 成品试剂盒步骤提取各细胞株基因组DNA，应用紫外线分光光度法检测提取DNA浓度和纯度，应用一步法DNA修饰试剂盒对所提取的DNA进行修饰，甲基化特异PCR扩增反应总体系25 μL，包括样本DNA 1.0 μL, 10×PCR buffer 2.5 μL, 甲基化或非甲基化引物各0.5 μL, dNTP 2 μL, Taq酶0.2 μL, PCR-Water 18.3 μL。MSP反应条件：95℃预变性10 min; 95℃ 1 min，甲基化及非甲基化均 68℃退火1 min, 72℃ 1 min, 45个循环；72℃延伸10 min。以未加引物只加PCR-Water的体系作为空白对照，梯度为100 bp 的1 000 bp DNA Ladder作为分子量标记，据相关文献提供序列合成引物：①SLIT2基因甲基化引物：上游序列：5′-TTG GGG CGC GGG TTT GGG TTT TTA CGC-3′，下游序列：5′-CGT AAA CGA CGC CGA CCC CAC TA-3′;②非甲基化引物： 上游序列：5′-TTG GGG TGT GGG TTT GGG TTT TTA TG-3′，下游序列：5′- CAT AAA CAA CAC CAA CCC CAC TA -3′ ，甲基化及非甲基化产物大小均为160 bp，2%琼脂糖凝胶电泳，设定电压100 V，电泳时间30 min，紫外凝胶成像系统下照相分析。每组实验均重复3次。

1.2.3 RT- PCR法分析SLIT2 mRNA表达 用TRIzol 法提取各HCC细胞总RNA, 紫外分光光度测定判断提取RNA浓度及纯度，按浓度算取 2 μg 总RNA，以其为模板并与逆转录酶和Oliga(dT)引物反应逆转录合成cDNA，SLIT2引物序列：上游序列：5′-GGT GTC CTC TGT GAT GAA GAG-3′，下游序列：5′-GTG TTT AGG AGA CAC ACC TCG-3′，SLIT2产物片段387 bp。选择GADPH为内参：其上游引物序列：5′-GAC CCC TTC ATG ACC TCA ACT ACA-3′，下游引物序列：5′-CTA AGC AGT TGG TGG TGC AGG A-3′，产物片段为100 bp，两对引物同时加入 25 μL 体系中，聚合酶链反应反应条件： 95℃ 预变性5 min; 95℃ 变性90 s, 61℃ 复性30 s, 72℃延伸30 s, 共30循环; 72 ℃延伸10 min。2%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，核酸凝胶图像分析仪摄影并分析RT-PCR产物。实验重复3次。

2 结果

2.1 5-Aza-CdR对SLIT2甲基化状态的影响 SLIT2基因在5种HCC细胞株中表现为异常高甲基化状态，未扩增出非甲基化产物，对各HCC细胞株用10 mmol/L浓度的5-Aza-CdR作用5 d后，各HCC细胞株MSP产物同时扩增出甲基化和非甲基化产物，表现为甲基化和非甲基化状态并存，而对照组未见扩增产物(图1)。实验得出，HCC细胞株中SLIT2基因启动子呈完全甲基化状态，去甲基化制剂5-Aza-CdR能使SLIT2基因异常高甲基化状态得到一定程度的逆转，使该基因启动子表现为部分甲基化现象，有效降低该基因甲基化程度。

2.2 SLIT2基因 mRNA的表达 以5-Aza-CdR干预前，SUN449、BEL-7402、Hep3B 细胞株中SLIT2 mRNA微弱表达甚至不表达，以10 mmol/L 浓度的5-Aza-CdR干预各细胞后，3种细胞株RT-PCR结果均出现明显产物条带，表明此3种HCC细胞株中异常高甲基化状态的SLIT2基因转录受到抑制，异常高甲基化状态得到逆转后重新获得mRNA的表达能力；在HCC细胞株SMMC-7721和HepG2中，5-Aza-CdR干预前后均可见mRNA表达(图2)。

3 讨论

神经生长导向因子2(SLIT2)基因被认为是候选抑癌基因[3]，是SLIT-ROBO基因家族成员之一，该基因家族编码的膜相关蛋白与ROBO相关基因表达的蛋白相互作用，发挥配体功能[4]，主要介导炎性趋化、细胞和凋亡、血管内皮的生成和移动[5]。SLIT2基因启动子异常高甲基化已在多系统肿瘤中被发现。本课题组前期实验证实SLIT2在HCC组织标本中甲基化率为78%[6]，在SUN449、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B和HepG2细胞株中均出现完全甲基化，甲基化率为100%，推测SLIT2基因异常甲基化使基因表达沉默可能在HCC的发生及侵袭、转移过程中起重要作用，提示SLIT2可能是HCC的靶基因。

DNA异常甲基化为表观遗传学变化[7]，其在原基因碱基排列顺序不变的基础上，通过加减甲基的方式改变基因结构，从而使改变后的基因表达发生变化，开启或关闭基因的表达行为，这就使对某些肿瘤相关基因，如抑癌基因的调控，改变其遗传特性作为治疗肿瘤的手段成为可能。甲基化调节剂能上调或下调基因甲基化水平，5-AZA-CdR为核苷类甲基化调节剂，主要作用于细胞周期的S期[8]，其机制主要通过特异性抑制DNA甲基转移酶活性阻断其甲基化反应[9]，下调基因甲基化状态而被研究用于抑制肿瘤的生长，其在间质性肿瘤中的基础和临床研究已初见成效，并逐渐被推广至实性肿瘤的研究中，Liu 等[10]用5-AZA-CdR干预中国视网膜母细胞瘤细胞株HXO-RB44发现，药物干预后HXO-RB44 抑癌相关基因RASSF1A甲基化率明显降低，且能抑制细胞生长、诱导细胞凋亡。Ma等[11]同时检测了肺癌癌旁组织及肺癌细胞株，发现Syk基因在肺癌细胞株异常高甲基化同时表达沉默，癌组织较癌旁组织Syk表达明显降低，4 μmol/L的5-Aza-CdR使异常高甲基化状态的Syk得到逆转而重新表达。Mirza等[12]用5-AZA-CdR联合PTX、ADR、5-FU对MDA、MB231 和MCF-7乳腺癌细胞株进行干预，发现联合10 μmol/L的5-Aza-CdR能增强化疗药物的作用，药物联合使用较单用5-Aza-CdR更显著降低 SLIT2基因的甲基化水平。

Liu等[13]研究发现5-Aza-CdR处理HCC细胞株Huh7后诱导甲硫氨酸腺苷转移酶-1A基因mRNA转录及相应蛋白表达，同时通过下调Bcl-2、上调 Bax 和Caspase-3抑制细胞生长。黄铀新等[14]用不同浓度的5-Aza-CdR作用HepG2细胞后，RT-PCR、Western blot分别检测DLK1基因及蛋白的表达水平，用MTT、Transwell和流式细胞术检测HepG2细胞的生长、侵袭性变化，发现处理后DLK1 mRNA及蛋白表达量均降低；HepG2细胞生长、增殖、侵袭能力得到抑制。在本实验中，对5种HCC细胞株进行多种基因的去甲基化检测，发现SLIT2基因在5种HCC细胞株中均出现甲基化产物条带而无非甲基化产物条带，提示SLIT2基因启动子区域在五种HCC细胞株中为完全甲基化，甲基化状态相同，证实SLIT2基因启动子区域在五种HCC细胞株中均呈异常高甲基化现象，提示SLIT2基因异常甲基化在肝癌细胞株中为普遍现象，SLIT2基因异常甲基化预示肿瘤的发生，为肝癌发生的表观遗传学特征之一。用去甲基化制剂5-Aza-CdR处理各HCC细胞株后，SLIT2基因甲基化和非甲基化产物条带同时出现，提示SLIT2基因异常甲基化得部分到逆转。同时在转录水平应用RT-PCR方法检测去甲基化处理后SLIT2基因再表达情况，RT-PCR显示处理前SLIT2 mRNA不表达或低表达，而处理后其产物表达则明显增加。SLIT2基因去甲基化伴随着转录水平的上调，说明两者存在着内在关联，可以认为该基因在肝癌细胞株中异常高甲基化导致了基因表达沉默，甲基化水平得到逆转后又部分恢复了转录表达水平，从而部分开放了基因功能。本实验5-Aza-CdR通过甲基化调节作用诱导SUN449、 BEL-7402、Hep3B 3种细胞株中原本微弱表达甚至低表达的SLIT2 mRNA 重新表达，与文献报道相符，但SMMC-7721和HepG2 细胞株中处理前后均出现明显条带，未得出5-Aza-CdR干预前后对转录的影响，原因可能是缺乏定量或半定量数据显示表达变化，也可能有其他遗传学及表观遗传学机制参与抑癌相关基因的调控，下一步研究拟运用定量及半定量的方法，设置药物的浓度梯度干预判定去甲基化干预效果，另外寻找基因去甲基化修饰与其他表观遗传学变化之间的内在联系，进一步探讨HCC去甲基化干预的潜在临床应用价值。

[1] Shariff MI, Cox IJ, Gomaa AI,et al.Hepatocellular carcinoma: current trends in worldwide epidemiology, risk factors, diagnosis and therapeutics[J].Expert Rev Gastroenterol Hepatol,2009,3(4):353-367

[2] 董桂银, 钱叶本, 耿小平,等. 肝细胞癌中SLIT2基因甲基化状态研究[J]. 肝胆外科杂志, 2006, 14(1): 62-65.

[3] Singh RK, Indra D, Mitra S, et al.Deletions in chromosome 4 differentially associated with the development of cervical cancer: evidence of slit2 as a candidate tumor suppressor gene[J].Hum Genet, 2007,122(1):71-81.

[4] Brose K, Bland KS, Wang KH, et al. Slit proteins bind robo receptors and have an evolutionarily conserved role in repulsive axon guidance[J]. Cell, 1999,96(6):795-806.

[5] Liu D, Hou J, Hu X,et al. Neuronal chemorepellent Slit2 inhibits vascular smooth muscle cell migration by suppressing small GTPase Rac1 activation[J]. Circ Res, 2006,98(4):480-489.

[6] 李培坤, 耿小平, 朱立新,等. HCC细胞株中SLIT2、DAPK、RIZ1、CHFR、EDNRB、3-OST-2基因甲基化状态的研究[J].安徽医科大学学报, 2010,46(5):412-415.

[7] Ozen C, Yildiz G, Dagcan AT,et al.Genetics and epigenetics of liver cancer[J]. N Biotechnol, 2013,30(4):381-4.

[8] Momparler RL. Pharmacology of 5-Aza-20-deoxycytidine (decitabine)[J]. Semin Hematol, 2005,42(3 Suppl 2):S9-16.

[9] 李培坤,耿小平,朱立新. DNA甲基化抑制剂研究进展[J].国际药学研究杂志,2010,37(3):198-202.

[10]Liu R,Zhang XH,Zhang K, et al. 5-Aza-2′-deoxycytidine inhibits retinoblastoma cell by reactivating epigenetically silenced RASSF1A gene[J]. Int J Ophthalmol,2014,7(1):51-56.

[11]Ma L, Dong S, Zhang P, et al.The relationship between methylation of the Syk gene in the promoter region and the genesis of lung cancer[J]. Clin Lab, 2010,56(9-10):407-416.

[12]Mirza S, Sharma G, Pandya P, et al. Demethylating agent 5-aza-2-deoxycytidine enhances susceptibility of breast cancer cells to anticancer agents[J]. Mol Cell Biochem, 2010,342(1-2):101-109.

[13]Liu WJ,Ren JG,Li T,et al, 5-Aza-2-deoxycytidine induces hepatoma cell apoptosis via enhancing methionine adenosyltransferase 1A expression and inducing S-adenosylmethionine production[J]. Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(11):6433-6438.

[14]黄铀新，罗耀玲，刘瑶.5-Aza-CdR抑制HepG2细胞DLK1基因表达及细胞生长[J].基础医学与临床,2013,8(33):215-219．

(2014-10-11 收稿 2014-12-21 修回)

5-Aza-CdR induces demethylation of SLIT2 gene in human hepatoma cell lines

LiPeikun,GengXiaoping

DepartmentofGeneralSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230601,China

Objective To investigate the effect of 5-Aza-CdR on methylation state and transcription of SLIT2 gene in hepatocellular carcinoma cell lines, and to discuss mechanism of SLIT2 gene silencing in 5 human hepatoma cell lines as well as the effect of demethylation agent on its expression.MethodsAll cell lines of SUN449, BEL-7402, SMMC-7721, Hep3B and HepG2 were cultured in vitro and treated with 10 mmol/L 5-Aza-CdR. The promoter methylation state of SLIT2 gene and the mRNA expression of SLIT2 gene in the 5 hepatoma cell lines before and after 5-Aza-CdR treatment were detected by methylation-specific PCP (MSP) and reverse transcription-PCR (RT-PCR), respectively.ResultsPromoter hypermethylation of SLIT2 gene was detected in all 5 hepatoma cell lines and SLIT2 gene was expressed at a low level before 5-Aza-CdR treatment. After treated with demethylation agent 5-Aza-CdR, the promoter region of SLIT2 gene exhibited demethylation state, and gene expression increased significantly at mRNA level.ConclusionPromoter hypermethylation is a main mechanism of SLIT2 gene silencing in 5 human hepatoma cell lines, and could be reversed by demethylation agent 5-Aza-CdR.

5-Aza-CdR; Hepatocellular carcinoma; SLIT2 gene; DNA methylation

安徽省科技攻关计划面上项目 (编号：08010302191)

230601 合肥 安徽医科大学第二附属医院普外科

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.02.002