术后认知功能障碍动物模型建立及神经行为学研究

钱晓岚, 王庆端, 张　卫, 周玉冰,

张晶敏2, 江金花3

(1. 河南省直第三人民医院 麻醉科, 河南 郑州, 450006; 2. 郑州大学 药学院, 河南 郑州, 450001;

3. 郑州大学 医药科学研究所, 河南 郑州, 450052; 4. 郑州大学第一附属医院 麻醉科, 河南 郑州, 450052)

术后认知功能障碍动物模型建立及神经行为学研究

钱晓岚1,2, 王庆端3, 张卫4, 周玉冰4,

张晶敏2, 江金花3

(1. 河南省直第三人民医院 麻醉科, 河南 郑州, 450006; 2. 郑州大学 药学院, 河南 郑州, 450001;

3. 郑州大学 医药科学研究所, 河南 郑州, 450052; 4. 郑州大学第一附属医院 麻醉科, 河南 郑州, 450052)

摘要:目的建立术后认知功能障碍动物模型，分析麻醉药物、手术创伤对小鼠神经行为学影响。方法健康老龄BALB/c小鼠随机分为空白对照组，麻醉药物组和手术组。术后第1、3、5、7天行Y迷宫试验，观察神经行为学改变，记录小鼠迷路分辨学习达到学会标准所需要的训练次数、潜伏期、主动逃避率。结果麻药组术后第1天，手术组术后第1、3、5天学习记忆能力受损，与对照组相比，潜伏期延长，错误率增加，训练次数增加，主动逃避率减少(P<0.01或P<0.05)。结论联合采用复合全麻药物及手术创伤方法制备的术后认知功能障碍小鼠模型能有效重现术后认知功能障碍患者的发病特点。

关键词:老龄; 麻醉; 手术创伤; 术后认知功能障碍; 模型

NMDA受体拮抗剂、GABA受体激动剂单用都可导致神经元毒性。大量文献显示麻醉和手术会加重随着年龄增长的中枢神经系统的退行性改变，老龄、麻醉药物、手术与POCD的发生有着重要联系。本研究模拟临床复合老龄、麻醉药物、手术创伤多种致病因素，建立了术后认知功能障碍动物模型，旨在重现术后认知功能障碍患者的发病特点，分析麻醉药物、手术创伤对小鼠神经行为学影响，并将其应用于术后认知功能障碍发病机制及其药物预防方面。

1材料与方法

1.1　材料

36只健康老龄BALB/c小鼠(月龄20～22 m, 体质量60～70 g, SPF级)，由河南省实验动物中心提供。动物生产许可证号为SCXK(豫)2010-0002，使用许可证号为SYXK(豫)2011-0010。IVC饲养环境下温度都维持在23 ℃, 12 h交替黑白周期,供应充足的水和食物，不健康的小鼠排除。

1.2　药品和仪器

药品：异氟醚(Nicholas Piramal公司，批号A01A11A)，氯胺酮(福建古田药业有限公司，批号130223); 仪器：Y型迷宫测试仪(上海软隆科技发展有限公司)

1.3　方法

经7～10 d适应环境后，将动物随机分为3组。空白对照组(n=12)不给予麻醉药物和实施手术；麻醉药物组(n=12)实验动物接受1.5%～2%异氟醚诱导1～2 min, 然后腹腔注射氯胺酮100 mg/kg, 持续吸入异氟醚60分达到相应手术最大刺激无痛，生命体征维持正常麻醉深度。麻醉药物手术组(n=12)小鼠给予复合麻醉药物后实施剖腹探查脾切除手术。具体手术操作步骤：首先切口处备皮、按无菌操作碘伏消毒,在上腹部正中线偏左做3～4 cm切口，进入腹腔后探查肝脾肠管约20 min, 切除脾脏，然后用缝线依次缝合腹膜、皮下组织及皮肤。术后待老鼠麻醉恢复后放回笼子里各自饲养。

Y迷宫实验:麻醉组、手术组分别于麻醉术后第1、3、5、7天行Y迷宫实验，记录各组所需的训练次数，潜伏期，主动逃避率；Y型迷宫装置由3个支臂和一个中间连接区组成，在每臂底部铺以与刺激电源相通细铜棒。信号灯装在各臂末端，信号灯开启的区域表示该臂为安全区，该臂底部不通电。实验开始时，让小鼠在起步区适应5 min左右，在安全区的信号灯亮起5 s后，开通刺激电源给起步区、非安全区通电，小鼠受电击后跑至信号灯亮起的安全区后结束一次训练。依次变换安全区和电击区的位置，重复以上训练过程直到小鼠达到学会的标准：连续10次测试中有9次正确，结束实验。记录训练次数，潜伏期，主动逃避率。小鼠的潜伏期即反应时间，是指从安全区信号灯亮开始到大鼠第1次逃至灯亮区为止所消耗的时间；主动逃避率指信号灯亮后起步区、非安全区未通电的5 s内完成逃避反应的次数占总反应次数的百分率。

1.4　统计学分析

所有数据采用SPSS 17.0处理。统计描述以均数±标准差(±s)表示，统计分析采用单因素方差分析，组间比较采用Dunnett T检验。对于不符合正态分布或方差齐的数据，做对数转换后进行统计检验。P<0.05认为有统计学意义。

2结果

与对照组相比，麻醉组术后第1天的空间记忆学习能力(P<0.05) 受到破坏，潜伏期延长，训练次数增加，主动逃避率减少，错误率增加，在术后第3天恢复(P>0.05) 。手术组小鼠在术后第1、3和5天寻找安全区潜伏期时间明显长于对照组小鼠(P<0.01或P<0.05)，主动逃避率减少(P<0.01或P<0.05), 总训练次数与对照组比较明显增加(P<0.01或P<0.05)，持续到术后第7天各项与对照组无明显差异(P>0.05)。见表1、2、3。

表1　Y迷宫实验中各组小鼠达标训练次数

与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01。

表2　Y迷宫实验中各组小鼠潜伏期

与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01。

表3　Y迷宫实验中各组小鼠主动逃避率

与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01。

3讨论

本研究手术创伤模型建立选取了剖腹探查脾切除术，研究结果证实手术创伤会导致实验鼠术后空间分辨学习能力、防御保护反射遭到破坏。与单纯麻药组相比，复合手术创伤更容易引起老年鼠术后认知功能障碍且持续的时间更长。海马参与中枢神经系统内信息系统功能的整合，是与学习记忆等大脑最高级的认知功能密切相关的重要部位。任何损毁海马造成损伤的因素均可能导致认知学习记忆功能下降。全麻药物通过调控特定的配基门控离子通道，主要是γ-氨基丁酸型A受体和N-甲基D-天门冬氨酸受体亚型-谷氨酸受体，从而改变突触的功能，改变神经突触可塑性[1]。全麻药物作用于大脑引起中枢神经递质生成、释放、储存和灭活过程异常和受体系统敏感度发生改变，这些均可导致术后学习、记忆力等认知功能的变化[2]。Culley等[3]研究显示,大鼠吸入异氟醚后，对老年大鼠的空间分辨记忆损害作用可持续数周。异氟烷通过激活内质网膜1，4，5三羟甲基氨基甲烷磷酸盐受体引起钙离子过度释放及减少组织型纤溶酶原激活物释放而启动内源性凋亡途径[4]。在体外和体内实验研究[5]已证明异氟烷的细胞毒性作用是引起认知功能障碍的危险因素。氯胺酮可与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体结合产生非竞争性抑制作用，抑制海马CA1 区对各种刺激作用后的长时程增强(LTP)效应，从而干扰学习记忆过程, 同时氯胺酮还可与nAch受体结合，促使NMDA受体通道亚单位NR2B mRNA 的表达下调， NMDA 受体的结构发生改变从而损害认知功能[6]。Morgan等[7]给予志愿者小剂量氯胺酮呈现出剂量依赖性的间断记忆和工作记忆损害，口服氯胺酮在3 d后出现语义记忆等多种记忆功能的损害，注意力不集中和精神分裂样症状。因此本实验麻醉药物采用神经损伤报道较多的异氟醚和氯胺酮 。

麻醉组术后第1天的空间记忆学习能力在术后第1天受到破坏，潜伏期延长，训练次数增加，主动逃避率减少，错误率增加，术后第3天已恢复至正常提示单纯的麻醉因素并不能引起认知功能的长时间破坏，实验动物单纯接受麻醉药物处理不是一个很好的POCD模型。大量研究[8]报道，是手术因素而非麻醉与精神紊乱、POCD的发生有密切的关系。强烈持续应激影响下丘脑垂体-肾上腺皮质轴功能改变，引起循环中糖皮质激素浓度增高，中枢Ach、NE和5-HT等递质产生释放发生紊乱，影响海马突触间联系导致记忆和学习能力下降。脾切除手术组的设立是为了给动物造成一定程度的创伤形成，有研究[9]认为手术侵袭程度的大小对老年人术后认知功能损害的影响不同，创伤程度大的手术后，患者术后更容易出现学习机记忆功能障碍。临床上术后认知功能障碍(POCD)多见于出血量多、手术时间长、创伤应激反应强烈的病人。手术创伤激活外周免疫系统释放各种炎性因子，C反应蛋白、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)、胶质细胞等在血液中和大脑组织中高表达。中枢小胶质细胞被激活后，释放类花生酸类物质、炎性因子、补体、过氧化物、兴奋性氨基酸和NO等可溶的炎性分子。Wan[10]研究显示脾切除手术后引起空间辨别、学习认知能力的下降与胶质细胞激活及海马区炎症介质的释放有关。Ramlawi等[11]研究发现，冠状动脉搭桥手术术后POCD发生的患者组C反应蛋白的表达水平显著升高。因此围术期手术创伤和应激引起的炎症反应在认知功能减退中起着重要作用。本实验手术组小鼠在术后第1、3和5天寻找安全区潜伏期时间明显长于对照组小鼠，主动逃避率减少，总训练次数明显增加持续到术后第7天同样证明手术创伤与认知功能有密切关系。

Y迷宫实验是测试动物海马依赖或非海马依赖空间学习记忆能力的较为普遍的方法[12]。训练期所测试的潜伏期代表实验动物的学习记忆能力，潜伏期越长其学习能力越差；主动逃避率反映受试动物的空间记忆保持能力，受试动物在灯亮后起跑时间越早主动逃避次数越多其记忆能力越强。小鼠能在电刺激尚未开始时根据安全区灯亮主动回避电击逃往安全区表明小鼠已经形成了明暗辨别条件反射。POCD是一个多因素的综合征，可能是在脑退行性改变及易感基因的基础上，在围术期的持续应激刺激和药物作用影响下多种因素共同作用导致的结果。手术创伤大、手术应激性高及体外循环心脏手术均是老年患者POCD高发因素。手术本身干扰人体内环境改变启动免疫级联反应，本试验结果同样提示中枢神经系统退行性改变与POCD的发生可能有着重要联系，而麻醉和手术会加重随着年龄增长中枢神经系统

经历的退行性改变，老龄、麻醉药物、手术与P0CD的发生有着重要联系。联合采用复合全麻药物及手术创伤方法制备的术后认知功能障碍小鼠模型能有效重现术后认知功能障碍患者的发病特点, 可将其进一步应用于发病机制及其药物预防方面的研究。

参考文献

[1]Franks N P. Molecular targets underlying general anaesthesia[J]. Br J Pharmacol, 2006, 147 (Suppl 1): S72.

[2]Culley D J, Baxter M G, Yukhananov R, et al. Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats[J]. Anesthesiology, 2004, 100(2): 309.

[3]Culley D J, Baxter M, Yukhananov R, et al. The memory effects of general anesthesia persist for weeks in young and aged rats[J]. Anesth Analg, 2003, 96(4): 1004.

[4]Wei H, Liang G, Yang H, et al. The common inhalational anesthetic isoflurane induces apoptosis via activation of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors[J]. Anesthesiology, 2008, 108(2): 251.

[5]Valentim A M, Alves H C, Silva A M, et al. Effects of depth of isoflurane anaesthesia on a cognition task in mice[J]. Br J Anaesth, 2008, 101(3): 434.

[6]Wang J, Zhou M, Wang X, et al. Impact of ketamine on learning and memory function, neuronal apoptosis and its potential association with miR-214 and PTEN in adolescent rats[J]. PLOS ONE, 2014,9(6): e99855.

[7]Morgan C J, Muetzelfeldt L, Curran H V. Consequences of chronic ketamine self-administration upon neurocognitive function and psychological wellbeing: a 1-year longitudinal study[J]. Addiction, 2010, 105(1): 121.

[8]He HJ, Wang Y, Le Y, et al. Surgery upregulates high mobility group box-1 and disrupts the blood-brain barrier causing cognitive dysfunction in aged rats[J]. CNS Neurosci Ther, 2012, 18(12): 994.

[9]Cao X Z, Ma H, Wang J K, et al. Postoperative cognitive deficits and neuroinflammation in the hippocampus triggered by surgical trauma are exacerbated in aged rats[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2010, 34(8): 1426.

[10]Wan Y, Xu J, Ma D, et al. Postoperative impairment of cognitive function in rats: a possible role for cytokine-mediated inflammation in the hippocampus[J]. Anesthesiology, 2007, 106(3): 436.

[11]Ramlawi B, Rudolph J L, Mieno S, et al. C-Reactive protein and inflammatory response associated to neurocognitive decline following cardiac surgery[J]. Surgery, 2006, 140(2): 221.

[12]Havekes R, Timmer M, Van der Zee E A. Regional differences in hippocampal PKA immunoreactivity after training and reversal training in a spatial Y-maze task[J]. Hippocampus, 2007, 17(5): 338.

论著

Establishment of POCD animal model and neurobehavioral study

QIAN Xiaolan1,2, WANG Qingduan3, ZHANG Wei4, ZHOU Yubing4,

ZHANG Jingmin2, JIANG Jinhua3

(1.DepartmentofAnesthesiology,TheThirdPeopleHospitalofHenanProvince,

Zhengzhou,Henan, 450006; 2SchoolofMedicine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,

Henan, 450001; 3.InstituteofMedicalScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,

Henan, 450052; 4.DepartmentofAnesthesiology,TheFirstAffiliatedHospital

ofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan, 450052)

ABSTRACT:ObjectiveTo establish a POCD model and to analyze the effects of anesthetic drugs and surgical trauma on the neurobehaviors. MethodsHealthy aging BALB/c mice were randomly divided into three groups: control group, anesthetic drugs group and surgery group. On the 1st, 3rd, 5th and 7th days after surgery, neurobehavioral changes were observed by Y maze test. Training times, latency time and active escape rate reached the standard for mice in the lost discrimination learning were recorded. ResultsThe impaired learning and memory appeared on 1st day in anesthetic drugs group and on 1st, 3rd and 5th day after surgery in surgery group, in which latency time was prolonged, the error rates increased, the training times increased and active escape rate reduced when compared with control group (P<0.01 orP<0.05). ConclusionThe POCD mice model is established through compound general anesthesia combined with surgical trauma, and this model can effectively reproduce POCD characteristics.

KEYWORDS:senile; anesthesiology; surgery trauma; postoperative cognitive dysfunction; model

基金项目:河南省医学科技攻关计划项目(201304073)

收稿日期:2015-04-25

中图分类号:R 332

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)21-001-03DOI: 10.7619/jcmp.201521001