地刷子石松提取物对免疫抑制小鼠血清中NO含量及NOS活性的影响*



地刷子石松提取物对免疫抑制小鼠血清中NO含量及NOS活性的影响*

**通讯作者，E-mail:biner70@sina.com

王娇，张涵淇，崔圆圆,胡鑫，王德彬**

(中南民族大学药学院，湖北 武汉 430074)

摘要：目的 研究地刷子石松乙酸乙酯提取物对免疫抑制小鼠血清中一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合酶(NOS)活性的影响。方法以环磷酰胺腹腔注射小鼠建立免疫抑制模型，以香菇菌多糖为阳性组，以50、100、200mg/kg的石松乙酸乙酯提取物为实验组，1次/d，连续给药10d，末次给药2h后检测血清中NO含量及TNOS活性。结果地刷子石松乙酸乙酯提取物能显著降低小鼠血清中TNOS活性及NO含量。结论地刷子石松乙酸乙酯提取物可能通过抑制小鼠TNOS活力来抑制NO的细胞毒作用，从而增强小鼠的免疫功能。

关键词：地刷子石松；免疫抑制小鼠；一氧化氮；一氧化氮合酶

地刷子石松为含地刷子碱、石松碱及多种三萜类化合物的石松科石松属植物，其主要用于风湿关节痛、舒筋活络，此外，它对肺热咳嗽、肌肉痉挛、跌打损伤、疮痈肿毒等也有一定的治疗作用。关于石松属植物的免疫调节功能少见文献报道。大量实验表明，环磷酰胺可通过抑制小鼠的细胞和体液免疫应答来抑制小鼠的免疫功能。故本实验以环磷酰胺诱导小鼠建立免疫抑制模型，探讨地刷子石松乙酸乙酯提取物对免疫抑制小鼠的免疫调节机制，从而为该类植物的应用和开发提供理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物昆明种雌、雄小鼠各30只，体质量18～22g，购于武汉生物制品研究所，动物许可证号：SCXK(鄂)2012-0003。

1.1.2药品及仪器环磷酰胺(阿拉丁试剂有限公司)，香菇菌多糖片(湖北广仁药业有限公司，生产批号：131003)，NO试剂盒(碧云天试剂有限公司)，NOS试剂盒(南京建成生物工程研究所)，M200型酶标仪(瑞士TECAN公司)，UV-1800PC紫外可见分光光度计(上海美谱仪器有限公司，生产批号：20141230)。

1.2方法

1.2.1实验动物处理将60只小鼠随机分成6组，每组10只，分别为正常组、模型组、阳性给药组和药物低、中、高浓度实验组。除正常组外，其余各组均在实验的第1、2、3d腹腔注射环磷酰胺溶液(80mg/kg)，正常组在实验第1、2、3d腹腔注射相同体积的生理盐水。从实验第1d起各实验组灌胃不同浓度(50、100和200mg/kg)的地刷子石松乙酸乙酯提取物，阳性药组灌胃100mg/kg香菇菌多糖溶液，正常组和模型组灌胃相同体积的生理盐水。

1.2.2实验动物取血连续灌胃10d，末次给药2h后所有小鼠眼眶摘眼球血于无抗凝剂的EP管中，所有血样于4℃倾斜静止放置1～2h至血液自然凝固，收集上层分离出的澄清透明的黄色血清。

1.2.3小鼠脾脏指数的测定采取脱臼法处死小鼠，解剖后称量脾脏重量。计算脏器指数：脾脏指数(mg/g)=脾脏重量/实验动物体重量。

1.2.4血清中NO含量测定制作NO标准曲线,以NaNO2为标准品，将NaNO2标准品稀释成0、1、2、5、10、20、50、100、150、200μmol/L梯度浓度的标准溶液，取96孔板，吸取标准溶液50μl,先后加入Griess试剂一、试剂二各50μl，每个浓度的标准溶液设置两个复孔，用酶标仪测定在550nm波长处的吸光度，并读取OD值，做回归曲线，计算回归方程。再另取一96孔板，孔中加入50μl待测血清，每个血清样品设两个复孔，用与前述相同的方法测定OD值。利用回归方程，计算NaNO2的浓度，换算成血清中NO含量。

1.2.5血清中总NOS活力的测定 根据总NOS试剂盒说明书操作，完成总NOS活力的测定，记录OD值，计算总NOS活力。

2结果

不同浓度地刷子石松乙酸乙酯提取物对小鼠脾脏指数及血清中NO含量、总NOS活力的影响。如表1所示，地刷子石松乙酸乙酯提取物高浓度组脾脏指数接近于正常组和阳性给药组，且高、中、低浓度组均与模型组差异显著，呈剂量依赖关系；地刷子石松乙酸乙酯提取物对小鼠血清中NO含量、NOS活力的影响也与浓度呈正相关，中、高浓度组与正常组相差不大，高剂量组更接近于正常组。

与正常组相比，#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001；与模型组相比,*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001

3讨论

脂溶性小分子NO是机体重要的化合物,能激活靶细胞中的鸟苷酸环化酶，发挥生物学作用。有文献表明，NO是一种自由基，在动物体内不仅可以发挥抗感染和免疫防疫的生理学作用，还可损伤正常组织或细胞，产生细胞毒性，发挥病理学作用。NO由NOS催化L-精氨酸合成，NOS包括内皮型(eNOS)、神经型(nNOS)、诱生型(iNOS)三种同功酶，降低NOS活力可以抑制NO过量产生。研究表明NO能在免疫系统细胞之间起着信号传递的作用[10]。已有实验[11]表明，在炎症或免疫抑制的动物模型中，NO浓度显著高于正常组，产生大量诱导性NO的细胞毒性，在细胞炎症的病理反应过程中起着主要作用，特征性炎症症状的缓解与NO含量的降低密切相关。

本研究结果表明，模型组血清NO含量及NOS活力与正常组相比，均存在显著性差异，说明造模成功；阳性给药组血清NO含量及NOS活力接近正常组，说明阳性药香菇菌多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠表现出明显的恢复作用[12]；地刷子石松乙酸乙酯提取物低、中、高浓度组NOS活力均接近正常组，中、高浓度组NO含量及NOS活力与正常组相比无显著性差异，且低、中、高浓度组脾脏指数与模型组相比均存在显著性差异，且高浓度组明显接近于正常组，说明地刷子石松乙酸乙酯提取物可明显提高免疫抑制小鼠的免疫功能。另有研究发现，环磷酰胺可使小鼠脾脏萎缩[13]，但本研究结果中环磷酰胺组的脾脏指数明显高于正常组，这可能与环磷酰胺浓度较高，小鼠脾脏发生代偿性增生有关。

综上所述，地刷子石松乙酸乙酯提取物可能通过抑制血清总NOS活力并最终抑制NO过量产生，降低其对正常组织细胞的细胞毒作用而发挥保护作用，从而提高免疫抑制小鼠的免疫功能，提示地刷子石松乙酸乙酯提取物具有免疫增强作用，且在一定浓度范围内，其免疫增强作用与浓度呈正相关。

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可能已经受到抑制，造模成功；DEM高剂量组的NO含量、NOS活力虽有升高，但小于DEM中剂量组，说明100 mg/kg的DEM不是建模的最佳给药量；DEM低剂量组、CY低、中剂量组的NO含量及NOS活力均低于正常组，说明造模不成功。

Effects of the Extract from Lycopodium Japonicum on Serum NO Content and NOS Activity in Immunosuppressed Mice

WANG Jiao,ZHANG Han-qi,WANG De-bin,et al

(CollegeofPharmacy，South-CentralUniversityforNationalities,WuhanHubei430074,China)

ABSTRACT：Objective To explore the effect of the extract from Lycopodium japonicum on serum content of nitric oxide (NO) and the activity of total nitric oxide synthase (NOS) in immunosuppressed mice. Methods The immunosuppressed model was built by intraperitoneal injection with cyclophosphamide.With lentinan as a positive control，the ethyl acetate extract from Lycopodium japonicum was administrated daily for 10 days by gavage at the doses of 50,100 and 200mg/kg，respectively.2 hours later after the last administration，the serum was collected and the NO content and NOS activity were determined.Results The serum content of NO and the activity of NOS in immunosuppressive mice of test groups were significantly reduced as compared to control group.Conclusion The ethyl acetate extract from Lycopodium japonicum can enhance the immunity of mice by inhibiting the activity of NOS and the content of NO.

KEY WORDS：Lycopodium japonicum；Immunosuppressed mice；Nitric oxide；Nitric oxide synthase

(收稿日期：2015-07-10)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2015.06.0463

中图分类号：R967

文献标识码：A

文章编号：2095-4646(2015)06-0463-03

*基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目(CZY15019)；中南民族大学十二五“民族药学”国家级实验教学示范中心项目