不同浓度环磷酰胺和地塞米松对小鼠免疫抑制模型建立的影响*



不同浓度环磷酰胺和地塞米松对小鼠免疫抑制模型建立的影响*

**通讯作者，E-mail:biner70@sina.com

张涵淇，王娇，崔圆圆，胡鑫，王德彬**

(中南民族大学药学院，湖北 武汉 430074)

摘要：目的 以不同浓度的环磷酰胺(CY)和地塞米松(DEM)建立小鼠免疫抑制模型，研究建模的最适剂量。方法CY组腹腔注射不同浓度的CY溶液(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)，DEM组腹腔注射不同浓度的DEM溶液(25mg/kg，50mg/kg和100mg/kg)，连续3 d,于第7d检测脏器指数、血清中NO含量和NOS活力。结果DEM中剂量组和CY高剂量组脾脏指数、NO含量以及NOS活力较正常组有明显升高；胸腺指数较正常组显著降低。结论50mg/kg 的DEM、100mg/kg CY为建立小鼠免疫抑制模型的最适剂量。

关键词：环磷酰胺；地塞米松；NO；NOS

作为应用广泛的抗癌药物，环磷酰胺对多种肿瘤均有抑制作用，同时大量实验证实，环磷酰胺能通过抑制细胞增殖来降低机体的免疫功能，因此常用来建立免疫抑制模型[1,2]。也有相关研究表明地塞米松可通过诱导白细胞和淋巴细胞数量的减少起到免疫抑制的效果。因此本研究以不同浓度环磷酰胺和地塞米松诱导小鼠建立免疫抑制模型，通过检测模型的胸腺指数、脾脏指数、血清中NO含量和NOS活力，来评价两种药物诱导建模的最佳剂量。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物昆明种小鼠70只，体质量18~22g。购于武汉生物制品研究所，动物许可证号SCXK(鄂)2012—0003。

1.1.2药品与试剂地塞米松磷酸钠注射液(天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司，批号：51408162)，环磷酰胺(阿拉丁试剂有限公司，批号：L1429054)，NO试剂盒(碧云天试剂有限公司，批号：S0021)，NOS试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20141230)。

1.1.3仪器M200酶标仪(瑞士TECAN)，UV-1800PC紫外可见分光光度计(上海美谱达器有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1小鼠分组及给药将70只小鼠随机分为7组，每组各10只。分别为正常组，地塞米松低、中、高剂量组，环磷酰胺低、中、高剂量组。正常组于实验的第1、2、3d腹腔注射生理盐水0.2ml/只，同时，地塞米松低、中、高剂量组分别腹腔注射地塞米松25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg，环磷酰胺低、中、高剂量组分别腹腔注射环磷酰胺25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg。

1.2.2血清中NO含量测定在实验的第7d，称取所有小鼠体重，摘眼球取血于EP管中，血液于4℃下静置2h后，3000r/min离心10min，上层的透明液体即为血清。制作NO标准曲线：以NaNO2为标准品，将NaNO2标准品稀释成0、1、2、5、10、20、50、100、150、200μmol/L梯度浓度的标准溶液，取96孔板，每孔加入NaNO2标准溶液50μl,依次加入Griess试剂1、Griess试剂2各50μl，每个浓度的标准溶液设两个复孔，用酶标仪检测550nm下的吸光度，做回归曲线，计算回归方程。另取96孔板，每孔用加样器加入血清50μl、Griess试剂一50μl、Griess试剂二50μl，每一个样品设两个复孔，加完样后立即用酶标仪测定550nm下样品的吸光度。

1.2.3血清中NOS活性测定每一个血清样品设两个复样，按NOS试剂盒说明书操作，用分光光度计测定吸光度(OD值)，计算NOS活力。

1.2.4小鼠脏器指数的测定脱颈椎处死小鼠，解剖后取脾脏、胸腺称重，按以下方法计算脏器指数。

脏器指数(mg/g)=脏器质量/小鼠体重

1.3统计方法 用GraphPad Prism 5软件处理所有实验数据，并进行t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同浓度DEM和CY对小鼠血清NO含量、NOS活性测定的影响由表1可知，与正常组相比，DEM低、中剂量组和CY高剂量组小鼠血清中NO浓度明显升高，DEM中剂量组和CY高剂量组NOS活力明显增强。

表1　不同浓度的DEM和CY对小鼠血清中NO含量及NOS活力的影响(n=10)

与正常组比较，*P<0.05、**P<0.01

2.2不同浓度DEM和CY对小鼠脏器指数的影响由表2可知，与正常组相比，DEM中剂量组和CY高剂量组脾脏指数明显升高，胸腺指数均有明显降低。

表2　不同浓度DEM和CY对小鼠脏器指数的影响(n=10)

与正常组比较，*P<0.05、**P<0.01

3讨论

目前，用来诱导小鼠免疫抑制模型的药物有氢化可的松、环磷酰胺、地塞米松等，其中环磷酰胺是应用最广泛，也是研究最多的一种建模药物。环磷酰胺属于烷化剂，可以与DNA形成交联，抑制DNA合成，从而抑制细胞增殖。地塞米松为甾体类抗炎药，能抑制巨噬细胞、淋巴细胞活性，促进胸腺细胞的凋亡。本实验采用剂量分别为25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml的环磷酰胺(CY)和地塞米松(DEM)建立小鼠免疫抑制模型，研究CY和DEM对小鼠血清中NO含量、NOS活性、脏器指数的影响，探讨二者建立免疫抑制模型的最佳剂量。

NO是中枢神经系统的一种神经递质，同时也在免疫功能的调控过程中发挥双重调控作用，正常情况下NO可促进巨噬细胞、中性粒细胞的活性，过量的NO则会导致组织的病理损伤。机体内的NO由NOS催化L-Arg产生。实验结果表明，DEM中剂量组和CY高剂量组的NO含量、NOS活力均远远高于正常组，提示这两组小鼠的免疫功能

当免疫细胞受到抗原刺激后，它们在脾脏进行增殖分化，而胸腺则是T细胞成熟的重要场所，因此脾脏和胸腺的相对重量和免疫功能有关。本实验结果表明，DEM中剂量组和CY高剂量组的脾脏指数显著高于正常组； DEM中剂量组和CY高剂量组的胸腺指数显著低于正常组，说明小鼠的免疫功能受到明显抑制。故50mg/kg的DEM和100mg/kg的CY为诱导小鼠建立免疫抑制模型的最佳浓度。

参考文献：

[1]赵弋清，罗霞，陈东辉,等.不同剂量环磷酞胺诱导正常小鼠免疫抑制的对比研究.免疫学杂志，2005,21(3)：122

[2]杨颖，蔡玟，黄志彪，等.环磷酰胺致小鼠免疫功能低下模型建立与评价.中国公共卫生，2008，24(5)：581

[3]李娟，李小花，邓婷，等.地塞米松诱导免疫抑制大鼠的血常规分析.赣南医学院学报，2012，32(4)：487

[4]张忠，程富胜，张霞，等.野菊花提取物对小鼠血清 NO、NOS的影响.中兽医医药杂志，2006，25(1):21

[5]齐丽娟,宋雁,王伟，等.用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型.卫生研究，2010,39(3):313

[6]张乐天,唐华侨,李英伦.氟苯尼考与地塞米松联用对小鼠免疫功能影响的研究.黑龙江畜牧兽医，2012,(5):154

[7]华川，闵晓俊，陈如泉.雷公藤对实验性自身免疫性甲状腺炎小鼠脾细胞悬液一氧化氮含量的影响.深圳中西医结合杂志，2011,21(2)：65

[8]范精华，刘康，刘保林.NO在炎症及免疫应答中的调节作用.中外医疗，2009，29(25)：163

[9]王晓燕， 李伟忠，梁磊，等.苦参碱对小鼠免疫器官的影响.时珍国医国药，2010，21(10):2545

Establishment of Immunosuppression Model Induced by Different

Doses of Cyclophosphamide or Dexamethasone in Normal Mice

ZHANG Han-qi,WANG jiao，WANG De-bin，et al

(CollegeofPharmacy,South-CentralUniversityforNationalities,WuhanHubei430074,China)

ABSTRACT：Objective To study the establishment of immunosuppressionmodel in mice with the best dosage of cyclophosphamide (CY) or dexamethasone (DEM). Methods he mice in CY or DEM groups were injected intraperinoteally with CY or DEM at doses of 25mg/kg,50mg/kg and 100mg/kg,respectively,for three days.Index of organs,the content of NO and the activity of NOS in serum of mice were tested after seven days.Results Index of spleen,the content of NO and the activity of NOS in middle-dosage group of DEM were significantly higher than those of normal group,and index of thymus was significantly decreased,as did high-dosage group of CY.Conclusion Middle-dosage group (50mg/kg) of DEM or high-dosage group (100mg/kg) of CY has the best immunosuppressive function in mice.

KEY WORDS：Cyclophosphamide;Dexamethasone;NO;NOS

(收稿日期：2015-07-10)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2015.06.0461

中图分类号：R967

文献标识码：A

文章编号：2095-4646(2015)06-0461-03

*基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目(CZY15019)；中南民族大学十二五“民族药学”国家级实验教学示范中心项目