禽流感检测技术的研究进展

黄俊姿

乌兰察布市集宁区动物疫病预防控制中心

禽流感检测技术的研究进展

黄俊姿

乌兰察布市集宁区动物疫病预防控制中心

禽流感（AI）是由A型禽流感病毒（AIV）引起的一种禽类的感染疾病综合征，不仅会造成巨大的经济损失，并且严重威胁着人类健康。由于流感病毒具有亚型多、抗原变异性较强和宿主范围广等特点。因此，建立一种快速、有效的流感病毒检测方法就显得非常重要。文章就目前流感病毒的检测技术，包括诊断做一综述，为了有效控制禽流感的发生与流行提供有力的技术支撑。

禽流感检测技术研究进展

一、禽流感概述

1887年，意大利首次发现禽流感，是世界动物卫生组织规定的A类传染病，中国也已将此病纳入一类传染病［1］。禽流感是由禽流感病毒（AIV）引起的一种禽类传染病，鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽均可感染，发病情况差别较大，有的出现急性死亡，有的无症状带毒。根据病毒核蛋白与基质蛋白的抗原性及其基因特性的不同，流感病毒可分为A、B、C型。禽流感病毒属于A型流感病毒，可感染人、马和猪及其他哺乳动物，家禽和野生禽类，禽流感一旦暴发往往给养禽业带来毁灭性的打击，并且严重威胁人类健康。因此，建立一种快速、高效的检测方法是预防禽流感的重要途径。

二、禽流感流行病学概括

高致病性禽流感主要病毒亚型为H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H7N1、H7N3、H7N4和H7N7。其中HPAI的主要特征是突然死亡和高死亡率，可以导致感染禽类的大量死亡。1983年美国泽西州、弗吉尼亚州和宾夕法尼亚州暴发禽流感，共计1250万只家禽被捕杀；1995年墨西哥发现的低致病性H5N2亚型流行株突变成高致病力毒株，波及12个州，共淘汰1800万只鸡，封锁3200万只鸡，1.3亿只鸡被紧急接种疫苗；2003年荷兰暴发了H7N7亚型的高致病性禽流感，大约有3000多万只禽类被捕杀；2003年底至2004年初，越南、泰国、韩国和中国等10多个国家相继暴发H5N1禽流感，在几个月的时间里，共有一亿多禽类死于此种疾病或是被捕杀。

1997年我国香港地区相继有18人感染H5N1病毒，其中6人死亡，此次感染人的病毒与香港鸡场暴发的HPAIV密切相关。2003年我国香港再次发生H5N1直接感染人事件，感染2例，1例死亡。2003年荷兰Gelderland省暴发高致病性禽流感H7N7，此次AIV暴发中确认的83例，感染者大多数是兽医和农场工作人员。从1例死于急性呼吸窘迫症的患者体内分离到H7N7病毒，未发现其他呼吸道病原。特别是2003年12月以来，越南、韩国和日本等亚洲国家先后暴发了大规模H5N1高致病性禽流感，在整个流行期间，越南共有22人确诊感染了H5N1高致病性禽流感，其中15人死亡，泰国12人感染，其中8人死亡，在越南还出现了人与人之间传染禽流感的疑似病例。2007年，印度尼西亚再一次暴发了H5N1高致病性禽流感感染人事件，死亡人数高达64人。AIV作为是否可有引起人类流感大暴发及其对人类健康的潜在威胁［2］是值得研究的热点问题。

三、禽流感检测技术

1.病毒的分离鉴定

在无菌条件下采集病料，常规处理后接种9～10日龄的鸡胚，收取尿囊液，测定其血凝活性，若结果是阴性则继续盲传2～3代。如有血凝活性，则应通过血凝抑制试验来确定分离的病毒是禽流感病毒、新城疫病毒还是禽腺病毒，如果抗禽流感的血清能抑制血凝现象的话，那样就证明有禽流感病毒存在。病毒分离鉴定法对禽流感的诊断准确性高，但操作程序繁琐，耗时费力，因此在临床诊断上一般不采取这种方法。

2.免疫学诊断技术

（1）琼脂扩散实验。其原理是利用可溶性抗原与抗体特异性结合，在琼脂中扩散形成浓度梯度来检测AIV群特异性血清抗体的一种试验方法。禽流感琼脂扩散试验简单易行，既可定性又可定量，但总体而言此法在检测禽流感抗体水平上的敏感度、准确度较低，易出现假阳性。

（2）神经氨酸酶抑制实验（NIT）。NIT主要用于禽流感病毒的亚型鉴定，其依据A型流感病毒的表面抗原特性，特别是神经氨酸酶的特性来鉴定流感病毒。

（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）。用酶标记抗原或抗体，通过显色反应来检测相应抗体或抗原的一种方法。本法具有特异、快速、敏感、微量的特点，因此，本法也常用于大批样品和血清学检疫。目前，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所已经建立了一系列ELISA方法，如建立了禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术、禽流感间接ELISA诊断试剂盒、禽流感Dot-ELISA方法等。

（4）病毒中和试验。病毒中和试验只有在抗体与病毒粒子上表面抗原相一致，特别是和吸附到宿主细胞上的病毒一致时，才能取得满意结果。其敏感性、特异性、检出率相当高，但操作繁琐，费时耗力，由于特异性高，所以很多新的检测方法都以这个方法作为标准来衡量。

（5）血凝（HA）试验和血凝抑制（HI）试验。HA和HI试验是诊断AIV和血清样品检疫中最常用的方法之一。由于家禽血清中存在着一些非特异性血凝抑制因子，在HI试验中常会造成一定数量的假阳性，因此进行HI试验前，血清样品除了需灭活外，还应该用高碘酸钠除去非特异性血凝抑制因子。

3.分子生物学检测

聚合酶链反应（PCR）、反转录-聚合酶链反应（RTPCR）、核酸探针和荧光PCR技术是应用分子生物学技术，以禽流感病毒RNA为检测目标所建立的一种快速检测诊断技术，已成功的应用于禽流感病毒的基因检测和分子流行病学调查。我国最新建立的禽流感病毒荧光RT-PCR诊断试剂盒已获得新兽药证书。除了上述已在常规实验室普遍应用的检测方法外，核酸依赖扩增技术（NASBA）以及基因芯片等基因诊断技术也在禽流感检测中发挥作用。

四、结语

控制禽流感需要采取多方面的措施，包括疫苗接种，严格的生物安全措施以及建立快速、高效、特异性高的诊断方法。尽管各国科研工作者已经建立了多种诊断禽流感病毒的方法，但是目前尚无一套固定成熟的防治方法。

［1］甘孟侯.禽流感［M］.3版.北京:中国农业出版社，2010:122-141.

［2］黄京燕，刘宏伟，赵海燕等.禽流感的危害及防控措施［J］.上海讯牧兽医通讯，2007（1）:55.