藏雪莲水提取物对中波红斑效应紫外线辐射后人角质形成细胞中蛋白表达的影响研究

郭 砚，孙 娟，王丽雯



·论著·

藏雪莲水提取物对中波红斑效应紫外线辐射后人角质形成细胞中蛋白表达的影响研究

郭 砚，孙 娟，王丽雯

目的 探讨藏雪莲水提取物对中波红斑效应紫外线(UVB)辐射后人角质形成细胞(HaCaT细胞)中白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、p53、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达水平。方法 体外培养HaCaT细胞，采用随机数字表法分为3组，对照组、UVB辐射组(UVB 30 mJ/cm2，辐射1 h)、藏雪莲水提取物组(UVB 30 mJ/cm2，辐射1 h+藏雪莲 5 g/L)，藏雪莲水提取物于UVB辐射前1 h加入细胞培养基中，辐射后18 h，收集细胞，采用台盼蓝染色观察细胞形态，检测HaCaT细胞IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3表达水平。结果 台盼蓝染色显示，UVB辐射组与对照组比较，HaCaT细胞蓝染数量增加，并出现肿胀、细胞漂浮，但仍可看出细胞形态；藏雪莲水提取物组与UVB辐射组比较，HaCaT细胞蓝染数量下降，细胞水肿程度减轻，并且细胞形态接近对照组。UVB辐射组与对照组比较，HaCaT细胞IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表达水平升高，Bcl-2表达水平降低(P<0.05)；藏雪莲水提取物组与UVB辐射组比较，HaCaT细胞IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表达水平降低，Bcl-2表达水平升高(P<0.05)。结论 藏雪莲水提取物能够降低UVB辐射后HaCaT细胞IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表达水平，升高 Bcl-2表达水平。

紫外线；辐射；藏雪莲；角质形成细胞；白介素6；肿瘤坏死因子α

郭砚，孙娟，王丽雯.藏雪莲水提取物对中波红斑效应紫外线辐射后人角质形成细胞中蛋白表达的影响研究[J].中国全科医学，2015，18(24)：2929-2933.[www.chinagp.net]

Guo Y,Sun J,Wang LW.Influence of Saussurea tridactyla Sch-Bip water extracts on the protein expression of HaCaT cells after UVB radiation[J].Chinese General Practice，2015，18(24)：2929-2933.

藏雪莲绝大部分产于我国青藏高原及其毗邻地区,属菊科凤毛菊属雪莲亚属草本植物，是传统珍贵藏药，含有挥发油、生物碱、甾醇、黄酮类、酚类、糖类、鞣质原糖和16种氨基酸、雪莲内酯以及钾、钙、锌、铁、镁等元素,具有较高的营养价值。中波红斑效应紫外线(UVB)(280～319 nm)辐射损伤是引起皮肤光老化最重要的因素，主要损伤皮肤角质形成细胞(HaCaT细胞)。已有研究证实，UVB辐射后可升高白介素6(IL-6)[1]、肿瘤坏死因子α(TNF-α)[2],降低线粒体膜电位并升高细胞内游离Ca2+[3]，激活p38激酶[4-6]，抑制B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)的表达[7]，进而引起半胱氨酸蛋白酶(Caspase)级联反应，引起细胞凋亡[8]。藏雪莲水提取物5 g/L能够减轻UVB辐射后HaCaT细胞的氧化损伤[9]，但关于p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、p53、Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Caspase-3表达尚未见报道。故本研究观察藏雪莲水提取物对UVB辐射后HaCaT细胞中IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达，探讨其减轻辐射损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 藏雪莲购自青海众康医药连锁有限公司，HaCaT细胞购自南京凯基生物科技发展有限公司；10%胎牛血清(FBS)购自Biological Industries，DMEM培养基购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司，胰酶购自Solarbio公司，台盼蓝染色液购自美国Sigma生物公司，IL-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒及TNF-α ELISA试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司；人p38MAPK酶联免疫试剂盒、人p53酶联免疫试剂盒、人Bcl-2酶联免疫试剂盒、人Bax酶联免疫试剂盒、人Caspase-3酶联免疫试剂盒均购自北京瑞格博科技发展有限公司；二氧化碳(CO2)培养箱购自上海力申科学仪器有限公司,IX71型Olympus倒置显微镜购自Olympus,飞利浦TL 20 W/12紫外线UVB灯管购自上海杰图商贸有限公司，UV-340A UVB辐照度监示器购自北京精密仪器科技有限公司，X-Mark型bio-rad酶标仪购自Bio-Rad公司，手持匀浆仪购自无锡沃信仪器有限公司,恒温混匀仪TS-100购自杭州瑞诚仪器有限公司。

1.2 藏雪莲水提取物的提取 根据文献[10]，准确称取100 g藏雪莲(藏雪莲经青海大学医学院药学系陈湘宏副教授鉴定)，加入蒸馏水浸泡过夜(料液比为1∶5)，加热至100 ℃后，文火(85 ℃)煎煮2 h，每隔15 min搅拌1次，过滤，滤渣加蒸馏水后继续煎煮，重复3次，过滤，合并滤液，冷冻干燥得到藏雪莲水提取物。以含10%FBS的DMEM培养基为溶剂，配置成藏雪莲水提取物5 g/L，并用0.22 μm孔径过滤器过滤，现配现用。

1.3 HaCaT细胞的培养 根据文献[11]，HaCaT细胞以含10%FBS的DMEM培养基(内含10 U/ml青霉素和10 U/ml链霉素)，接种于培养瓶后，置于37 ℃，5% CO2饱和湿度的培养箱，当细胞达90%融合时传代，取处于对数生长期3～5代的细胞用于实验。

1.4 实验分组 当HaCaT细胞达到85%～90%融合时，将培养瓶内的细胞按1×106ml细胞浓度传到96孔板及6孔板中继续培养。当细胞达80%～90%融合时，采用随机数字表法分为3组，对照组、UVB辐射组(UVB 30 mJ/cm2，辐射1 h)、藏雪莲水提取物组(UVB 30 mJ/cm2，辐射1 h+藏雪莲 5 g/L)。UVB辐射前1 h将HaCaT细胞用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3遍，并将藏雪莲水提取物加入培养基中，对照组用锡纸包住置暗处，UVB辐射组和藏雪莲水提取物组打开培养皿盖，在预设好的UVB辐射仪中照射1 h，立即用无菌PBS洗涤3遍，并加含10%FBS的DMEM培养基继续培养18 h。

1.5 实验方法

1.5.1 台盼蓝染色 将含10% FBS的DMEM培养基的96孔板，无菌PBS洗涤3遍，各组细胞中每孔加入0.4%台盼蓝染色液50 μl，3 min，IX71型Olympus倒置显微镜照相系统观察并摄片。

1.5.2 IL-6、TNF-α表达水平检测 贴壁细胞用胰液消化，手持匀浆仪裂解细胞，1 500×g离心10min后，吸取上清液，将100 μl不同浓度的标准品(0～100 pg/ml IL-6、0～1 000 pg/ml TNF-α)及样本(各组细胞的上清液)加入酶标板，覆膜后37 ℃温育2 h，弃去液体甩干，每孔加A工作液(IL-6、TNF-α ELISA试剂盒内配备)100 μl，覆膜后37 ℃温育1 h，弃去液体，洗板机洗板3次，甩干后每孔加B工作液(IL-6、TNF-α ELISA试剂盒内配备)100 μl，覆膜后37 ℃温育30 min，弃去液体，洗板机洗板5次，甩干后每孔加底物溶液90 μl，覆膜后37 ℃避光显色15～25 min，每孔加终止溶液50 μl，于酶标仪450 nm波长处测量各孔的吸光度并记录结果，每组单独重复测量5次。实验步骤按照IL-6、TNF-α ELISA试剂盒说明书进行。

1.5.3 p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3表达水平检测 贴壁细胞用胰液消化，手持匀浆仪裂解细胞，1 500×g离心10 min，吸取上清液，除空白孔外，标准品孔和样品孔分别加入标准品(p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3)和样品(各组细胞的上清液)50 μl，加入酶标试剂50 μl，覆膜后37 ℃孵育1 h，弃去液体，洗板机洗板5次，每孔加入显色试剂A、显色试剂B(p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3试剂盒内配备)各50 μl，37 ℃避光显色10 min，每孔加终止液50 μl，以空白孔调零后，酶标仪450 nm波长测定各孔吸光度并记录结果。每组单独重复5次。实验步骤按照p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 台盼蓝染色结果 UVB辐射组与对照组比较，HaCaT细胞蓝染数量增加，并出现肿胀、细胞漂浮，但仍可看出细胞形态；藏雪莲水提取物组与UVB辐射组比较，HaCaT细胞蓝染数量下降，细胞水肿程度减轻，并且细胞形态接近对照组(见图1)。

2.2 3组HaCaT细胞IL-6、TNF-α表达水平比较 3组HaCaT细胞IL-6、TNF-α表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05)；其中UVB辐射组与对照组比较HaCaT细胞IL-6、TNF-α表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)；藏雪莲水提取物组与UVB辐射组比较HaCaT细胞IL-6、TNF-α表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.3 3组HaCaT细胞p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3表达水平比较 3组HaCaT细胞p38MAPK、p53、Bcl-2、Bax、Caspase-3表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中UVB辐射组与对照组比较HaCaT细胞p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表达水平升高,Bcl-2表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；藏雪莲水提取物组与UVB辐射组比较HaCaT细胞p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表达水平降低,Bcl-2表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

3 讨论

青藏高原具有高海拔、强紫外线和缺氧的地理环境，居住人群长期暴露于强紫外线中，导致皮肤光老化，引发多种皮肤疾病,尤其表现在皮肤UVB损伤和皮肤癌发病率不断增加。而藏雪莲是最负盛名的高山植物之一，性辛热,有“通经活血，祛风胜湿”和暖宫散疹等功效,具有散寒除湿、壮阳补血、抗炎镇痛、延缓衰老等作用[12-13]。

UVB损伤皮肤角质形成细胞是引起皮肤光老化的最重要因素。既往研究证实，UVB辐射后可升高IL-6[1]、TNF-α[2],降低线粒体膜电位，升高细胞内游离Ca2+[3]，激活p38激酶[4-6]，活化下游p53，特异地降低Bcl-2的表达水平[7]，提高Bax的表达水平，进而引起Caspase级联反应，引起细胞凋亡[8]。但目前为止，藏雪莲水提取物能否通过降低IL-6、TNF-α表达水平，降低UVB辐射后HaCaT细胞的炎症损伤以及通过降低p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3，升高Bcl-2，减轻UVB辐射后HaCaT细胞凋亡，进而减轻HaCaT细胞形态学变化的文献尚未见报道。因此，本研究主要通过台盼蓝染色观察UVB辐射后HaCaT细胞的形态学变化，并通过观察UVB辐射HaCaT细胞中炎性因子(IL-6、TNF-α)及凋亡相关因子(p38MAPK、p53、Bax、Bcl-2、Caspase-3)的表达情况，来探讨藏雪莲水提取物能否通过降低炎性因子及凋亡因子来减轻UVB辐射后HaCaT细胞的形态学变化，进而减轻UVB辐射对HaCaT细胞的辐射损伤。

Table 1 Comparison of the expression level of IL-6 and TNF-α of HaCaT cells among the three groups

组别IL-6TNF-α对照组15.77±1.0832.59±1.56UVB辐射组27.46±0.48a79.97±2.96a藏雪莲水提取物组21.66±0.88b37.12±1.39bF值282.24981.52P值<0.001<0.001

注：UVB=中波红斑效应紫外线，IL-6=白介素6，TNF-α=肿瘤坏死因子α；与对照组比较，aP<0.05；与UVB辐射组比较，bP<0.05

UVB=中波红斑效应紫外线

图1 3组HaCaT细胞台盼蓝染色结果(×10)

注：p38MAPK=p38丝裂原活化蛋白激酶,Bcl-2=B细胞淋巴瘤因子2,Bax=Bcl-2相关X蛋白,Caspase-3=半胱氨酸蛋白酶3；与对照组比较，aP<0.05；与UVB辐射组比较，bP<0.05

本研究结果表明，HaCaT细胞经UVB照射后，出现轻度肿胀、漂浮，且台盼蓝蓝染细胞数量增加，但细胞形态仍可看出，藏雪莲水提取物组与UVB辐射组比较，细胞形态明显恢复，蓝染细胞数量明显下降，细胞死亡碎片及脱片现象明显改善；UVB辐射组与对照组比较，IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表达水平上升，Bcl-2表达水平下降，藏雪莲水提取物组与UVB辐射组比较，IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表达水平下降，Bcl-2表达水平上升。说明藏雪莲水提取物能够通过降低UVB辐射后炎性因子及凋亡因子的表达来减轻HaCaT细胞的辐射损伤。

本研究结果证实，藏雪莲水提取物能够降低HaCaT细胞经UVB辐射后IL-6、TNF-α、p38MAPK、p53、Bax、Caspase-3表达水平，升高Bcl-2表达水平，减轻UVB辐射后HaCaT细胞炎性因子及凋亡因子的表达，进而减轻UVB辐射后HaCaT细胞的辐射损伤，并为进一步探讨藏雪莲水提取物在UVB光保护作用的机制提供理论基础。

利益冲突声明：本课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。无利益冲突。

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(本文编辑：陈素芳)

Influence of Saussurea Tridactyla Sch-Bip Water Extracts on the Protein Expression of HaCaT Cells After UVB Radiation

GUOYan,SUNJuan,WANGLi-wen.

DepartmentofSkinDiseaseandVenerealDivision，AffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,Xining810001,China

Objective To investigate the influence of Saussurea tridactyla Sch-Bip (SSB) water extract on the expressions of interleukin 6 (IL-6),tumor necrosis factor alpha (TNF-α),p38 mitogen activated protein kinase (p38MAPK),p53,B cell lymphoma factor 2 (Bcl-2),Bcl-2 associated X protein (Bax),cysteine proteinase 3 (Caspase-3) in HaCaT cell after medium wave ultraviolet erythema effect of ultraviolet rays (UVB) radiation.Methods HaCaT cells were cultured in vitro and randomly divided into 3 groups:control group,UVB radiation group (30 mJ/cm2,radiation 1 h,UVB group),UVB+SSB group (UVB 30 mJ/cm2,radiation 1 h +SSB 5 g/L).One hour before UVB irradiation,SSB water extracts were added into the culture medium.18 hours after UVB radiation,cells were collected.The morphology of cells were observed by trypan blue staining.The expressions level of IL-6,TNF-α,p38MAPK,p53,Bcl-2,Bax and Caspase-3 were detected.Results Compared with control group,in UVB radiation group,the number of HaCaT cells stained increased,HaCaT cells appeared swelled and floated,but the cell morphology could still be seen;compared with UVB radiation group,in UVB+SSB group,the number of HaCaT cells stained decreased,HaCaT cells appeared less swelled， and the morphology of cells were largely restored.UVB radiation group was higher (P<0.05) in the expressions level of IL-6，TNF-α，p38MAPK，p53，Bax，Caspase-3 and lower (P<0.05) in Bcl-2 expression than control group;UVB+SSB group was lower (P<0.05) in the expressions level of IL-6，TNF-α，p38MAPK，p53，Bax and Caspase-3 and higher (P<0.05) in the expression level of Bcl-2 than UVB radiation group.Conclusion SSB water extracts can reduce the expressions level of IL-6,TNF-α,p38MAPK,Bax,Caspase-3 and increase the expression level of Bcl-2 in HaCaT cells after UVB radiation.

Ultraviolet rays；Radiation；Tibetan saussurea；HaCaT cell；Interleukin-6；Tumor necrosis factors α

青海省科学计划项目(2013-Z-003)

810001青海省西宁市，青海大学附属医院皮肤病与性病学(郭砚)；青海大学研究生院(孙娟，王丽雯)

郭砚，810001青海省西宁市，青海大学附属医院皮肤病与性病学；E-mail:qhguoyan@163.com

R 358.4

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.24.012

2015-03-26；

2015-07-02)