bcl-2小分子干扰RNA对人子宫内膜癌RL-952细胞阿霉素敏感性的影响

周夫群，黄章骞，何 尧



·论著·

bcl-2小分子干扰RNA对人子宫内膜癌RL-952细胞阿霉素敏感性的影响

周夫群，黄章骞，何 尧

目的 研究靶向bcl-2小分子干扰RNA(siRNA)干扰序列对人子宫内膜癌RL-952细胞阿霉素(DOX)敏感性的影响及相关作用机制。方法 2014年5—8月，将siRNA干扰序列转染人子宫内膜癌RL-952细胞，设3个实验组：空白对照组、bcl-2 siRNA干扰组(转染bcl-2 siRNA干扰序列)及阴性对照组(转染siRNA空载序列)，检测bcl-2 siRNA干扰组的转染效率和3组bcl-2表达水平。将细胞随机分成5组，分别为空白对照组、阴性对照组(转染siRNA空载序列)、干扰组(转染bcl-2 siRNA干扰序列)、DOX组(加入5 μg/ml DOX)、联合组(转染siRNA干扰序列并加入5 μg/ml DOX)，检测细胞活力、细胞凋亡率、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平。结果 siRNA干扰序列转染人子宫内膜癌RL-952细胞的转染效率为(94.6±12.5)%。3组bcl-2表达水平比较，差异有统计学意义(F=8.75，P<0.05)。bcl-2 siRNA干扰组bcl-2表达水平低于空白对照组和阴性对照组(q=3.99、2.87，P<0.01)。5组细胞活力比较，差异有统计学意义(F=42.52，P<0.05)。干扰组、DOX组、联合组细胞活力低于空白对照组(q=7.66、8.64、6.89，P<0.05)；联合组细胞活力低于DOX组(q=6.76，P<0.01)。5组细胞凋亡率比较，差异有统计学意义(F=112.34，P<0.05)。干扰组、DOX组、联合组细胞凋亡率高于空白对照组(q=5.78、4.99、6.21，P<0.05)；联合组细胞凋亡率高于DOX组(q=4.89，P<0.01)。5组Caspase-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。干扰组、DOX组、联合组Caspase-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平高于空白对照组(P<0.05)；DOX组、联合组Caspase-3活性高于阴性对照组，干扰组、DOX组、联合组Caspase-9活性高于阴性对照组(P<0.05)；联合组Caspase-3活性高于干扰组，DOX组、联合组Caspase-9活性高于干扰组(P<0.05)；联合组Caspase-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平高于DOX组(P<0.05)。结论 靶向bcl-2 siRNA干扰序列可以增强人子宫内膜癌RL-952细胞的DOX敏感性，bcl-2可作为人子宫内膜癌基因治疗的候选靶点。

子宫内膜肿瘤；基因,bcl-2；RNA,小分子干扰；阿霉素；半胱氨酸蛋白酶类

周夫群，黄章骞，何尧.bcl-2小分子干扰RNA对人子宫内膜癌RL-952细胞阿霉素敏感性的影响[J].中国全科医学，2015，18(24)：2917-2921.[www.chinagp.net]

Zhou FQ,Huang ZQ,He Y.Influence of bcl-2 small interference RNA on the sensibility of endometrial carcinoma RL-952 cells to doxorubicin[J].Chinese General Practice，2015，18(24)：2917-2921.

子宫内膜癌(endometrial carcinoma)是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，好发于围绝经期和绝经后女性。子宫内膜癌是最常见的女性生殖系统肿瘤之一，每年有接近20万的新发病例，是导致死亡的第3位常见妇科恶性肿瘤(仅次于卵巢癌和宫颈癌)[1-2]。目前，我国已进入了老龄化社会，随着老年人口数量的增加，子宫内膜癌患者中老年人比例也随之增加。由于老年患者多伴有并发症，加之一些重要器官如：肝脏、肾脏、骨髓生理功能减弱，进而耐受放疗、化疗的能力也随之减弱，因此，开辟新的治疗途径迫在眉睫。

小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)技术是近年来发展的一种特异性抑制基因表达的新方法，通过具有同源性的双链RNA(dsRNA)迅速阻断mRNA表达活性，诱导序列特异的靶基因沉默，是分子生物学实验室中一种强大的实验工具[3-5]。本研究通过siRNA技术抑制人子宫内膜癌RL-952细胞中bcl-2基因的表达，同时联合化疗药物阿霉素(doxorubicin，DOX)，以观察其联合作用对人子宫内膜癌RL-952细胞活力及凋亡的影响，初步探讨相关作用机制，为临床治疗子宫内膜癌提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株和试剂 人子宫内膜癌细胞株RL-952购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和RPMI 1640培养基购自HyClone公司。DOX购自武汉三洹医药化工有限公司。bcl-2 siRNA干扰序列及转染试剂盒由上海吉凯基因化学技术有限公司设计并合成。细胞裂解液、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9和细胞色素C活性检测试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司。BCA蛋白定量试剂盒、鼠抗人β-actin一抗、鼠抗人bcl-2一抗和羊抗鼠二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司。Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。四甲基氮唑蓝(methylthiaLzolyItetraLzolium，MTT)粉末购自美国Sigma-Aldrich公司。脂质体转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 2014年5—8月，人子宫内膜癌RL-952细胞常规培养于含10%FBS的RPMI 1640培养基中，经0.25%胰蛋白酶消化传代后置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中，隔天传代。

1.2.2 siRNA干扰序列转染人子宫内膜癌RL-952细胞并检测转染效率 将对数生长期的人子宫内膜癌RL-952细胞制备成单细胞悬液(3.0×105/ml)接种在6孔细胞培养板中，每孔2.0 ml细胞悬液，待细胞贴壁后，参照脂质体转染试剂Lipofectamine 2000说明书进行siRNA干扰序列转染操作。设3个实验组：空白对照组、bcl-2 siRNA干扰组(转染bcl-2 siRNA干扰序列)及阴性对照组(转染siRNA空载序列)。孵育4 h后更换常规新鲜培养基继续培养20 h，收集细胞验证bcl-2 siRNA干扰组转染效率。

1.2.3 检测bcl-2表达水平 用2 ml预冷磷酸盐缓冲液(PBS)淋洗3组细胞后，每孔加入500 μl细胞裂解液，按照说明书步骤提取蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒调整蛋白水平，制作聚丙烯酰胺浓缩胶和分离胶，每组取40 μg蛋白样品进行电泳，经转膜、封闭、一抗(鼠抗人β-actin一抗、鼠抗人bcl-2一抗)和二抗(羊抗鼠二抗)孵育和洗涤(一抗稀释比为1∶500；二抗稀释比为1∶3 000)。ECL显色后，经全自动电泳凝胶分析系统扫描曝光并通过Gene Tool软件分析各组bcl-2表达水平。

1.2.4 检测细胞活力 将对数生长期的人子宫内膜癌RL-952细胞制备单细胞悬液，以每孔5.0×103个细胞接种于96孔培养板中。随机分成5组，分别为空白对照组、阴性对照组(转染siRNA空载序列)、干扰组(转染bcl-2 siRNA干扰序列)、DOX组(加入5 μg/ml DOX)、联合组(转染siRNA干扰序列并加入5 μg/ml DOX)，每组设8个复孔，DOX浓度参照本实验室前期预实验结果。处理24 h后，2 000 r/min离心10 min(离心半径3 cm)，弃上清液，每孔加入100 μl MTT溶液(终浓度为0.05 mg/ml)，37 ℃避光继续孵育4 h，2 000 r/min离心10 min(离心半径3 cm)，弃上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)溶解结晶，酶标仪读取吸光度(A540值)。

1.2.5 检测细胞凋亡率 将对数生长期的人子宫内膜癌RL-952细胞制备成单细胞悬液，以每孔6.0×105个细胞接种于6孔培养板中。分组方法同上，人子宫内膜癌RL-952细胞按细胞活力检测方法处理24 h后，预冷PBS洗涤2次，0.25%胰酶消化，以1 500 r/min离心10 min(离心半径3 cm)，收集细胞，制备成浓度为5.0×106/ml的单细胞悬液；取100 μl细胞悬液，加入400 μl 1×Binding Buffer重悬细胞，分别加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI溶液混匀，室温避光孵育20 min，流式细胞仪上检测细胞凋亡率。

1.2.6 检测Caspase-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平 将对数生长期的人子宫内膜癌RL-952细胞制备单细胞悬液，将2.0×107个细胞接种于25 ml细胞培养瓶中。分组方法同上，人子宫内膜癌RL-952细胞按细胞活力检测方法处理24 h后，制备成单细胞悬液，调整细胞浓度至1.0×107/ml，每107个细胞加入1 ml细胞裂解液，参照试剂盒方法分别提取总蛋白和胞质蛋白，其中，总蛋白用于检测Caspase-3、Caspase-9活性，胞质蛋白用于检测胞质细胞色素C水平，检测步骤按ELISA试剂盒操作说明书进行。

2 结果

2.1 转染效率 bcl-2 siRNA干扰序列转染人子宫内膜癌RL-952细胞的转染效率为(94.6±12.5)%。

2.2 bcl-2表达水平比较 空白对照组bcl-2表达水平为(1.109±0.002)，bcl-2 siRNA干扰组为(0.447±0.001)，阴性对照组为(1.126±0.004)。各组bcl-2 表达水平比较，差异有统计学意义(F=8.75，P<0.05)。bcl-2 siRNA干扰组bcl-2 表达水平低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(q=3.99、2.87，P<0.01，见图1)。

注：siRNA=小分子干扰RNA

图1 bcl-2表达水平

Figure 1 Expression level of bcl-2

2.3 细胞活力比较 空白对照组细胞活力为(100.0±0.2)%，阴性对照组为(99.5±1.8)%，干扰组为(83.0±3.6)%，DOX组为(79.0±0.7)%，联合组为(63.0±1.6)%。5组细胞活力比较，差异有统计学意义(F=42.52，P<0.05)。干扰组、DOX组、联合组细胞活力低于空白对照组，差异有统计学意义(q=7.66、8.64、6.89，P<0.05)；联合组细胞活力低于DOX组，差异有统计学意义(q=6.76，P<0.01)。

2.4 细胞凋亡率比较 空白对照组细胞凋亡率为(2.3±0.2)%，阴性对照组为(3.4±0.4)%，干扰组为(18.4±1.2)%，DOX组为(22.3±4.2)%，联合组为(39.2±3.7)%。5组细胞凋亡率比较，差异有统计学意义(F=112.34，P<0.05)。干扰组、DOX组、联合组细胞凋亡率高于空白对照组，差异有统计学意义(q=5.78、4.99、6.21，P<0.05)；联合组细胞凋亡率高于DOX组，差异有统计学意义(q=4.89，P<0.01)。

2.5 Caspase-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平比较 各组Caspase-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。干扰组、DOX组、联合组Caspase-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；DOX组、联合组Caspase-3活性高于阴性对照组，干扰组、DOX组、联合组Caspase-9活性高于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；联合组Caspase-3活性高于干扰组，DOX组、联合组Caspase-9活性高于干扰组，差异有统计学意义(P<0.05)；联合组Caspase-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平高于DOX组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table 1 Comparison of the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level among different groups

组别Caspase-3(μmolpNA/109cell)Caspase-9(μmolpNA/109cell)细胞色素C(μmol/mg)空白对照组4.14±2.973.12±1.270.13±0.06阴性对照组5.68±1.084.27±1.990.18±0.01干扰组9.25±1.54b8.25±1.25bc3.61±1.42bDOX组12.53±3.12bc10.97±2.02bcd5.33±2.00b联合组21.45±4.22bcde15.65±2.24bcde10.13±2.54beF(u)值35.5648.1010.60aP值0.0430.0380.029

注：a为u值；与空白对照组比较，bP<0.05；与阴性对照组比较，cP<0.05；与干扰组比较，dP<0.05；与DOX组比较，eP<0.05；Caspase=半胱氨酸蛋白酶

3 讨论

细胞凋亡是一种细胞自发的生理性死亡，与病理性细胞坏死不同，凋亡是由多基因精确调控的过程，对多细胞有机体的正常发育和自身稳定具有极其重要的生物学作用，细胞凋亡失衡与许多疾病尤其是与肿瘤的发生相关联[6]。研究表明，细胞凋亡在肿瘤发生发展中起负调控作用，凋亡受抑制，最终可能导致细胞癌变或肿瘤，而过度凋亡则与神经退行性疾病等有关[3，7-8]。bcl-2基因家族是目前广泛研究的一类细胞凋亡基因，其表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一。根据其对细胞凋亡的作用特点，可将bcl-2家族分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，其中，促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白之间的比例决定着细胞对各种凋亡因素(如化疗药物)的敏感性[9-10]。DNA损伤类化疗药物可通过上调凋亡相关基因(Bax)/bcl-2来改变线粒体外膜完整性，诱发线粒体膜通道开放，导致细胞色素C等细胞凋亡执行因子释放入胞质，从而启动肿瘤细胞凋亡过程。虽然放疗和化疗均可通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗癌作用，但肿瘤组织中常会出现耐受细胞群，引起化疗和放疗的治疗效率降低，并最终导致恶性肿瘤复发和浸润转移[11-12]。因此，开发靶向抗凋亡蛋白bcl-2的化疗药物是当前研究抗肿瘤药物的热点。本研究以人子宫内膜癌RL-952细胞为研究对象，观察靶向bcl-2 siRNA干扰序列联合DOX处理对人子宫内膜癌RL-952细胞增殖的抑制作用，验证通过医疗手段抑制bcl-2在子宫内膜癌治疗中的作用及可行性。

本研究结果显示，siRNA干扰序列转染人子宫内膜癌RL-952细胞的转染效率为(94.6±12.5)%，提示转染成功。干扰组、DOX组、联合组细胞活力低于空白对照组；联合组细胞活力低于DOX组。提示在本实验体系中，靶向bcl-2 siRNA干扰序列转染和DOX处理两者联合作用在抑制人子宫内膜癌RL-952细胞增殖上有明显的协同效果。Caspase家族是哺乳动物细胞中程序性死亡(PCD)的主要介导者和执行者，包括以Caspase-9为代表的凋亡启动因子和Caspase-3为代表的凋亡执行因子，当细胞接受凋亡信号后，Caspases家族成员可被级联激活，其中Caspase-9位于级联反应最上游，可在其他协同因子参与下发生自我活化并激活下游凋亡执行因子Caspase-3，后者则作用于特异性底物使细胞发生一系列生化及形态学改变，最终导致细胞凋亡[13-16]。线粒体细胞色素C的释放是线粒体依赖性细胞凋亡的标志事件[17]。本研究结果显示，bcl-2 siRNA干扰组bcl-2 表达水平低于空白对照组和阴性对照组；干扰组、DOX组、联合组细胞凋亡率高于空白对照组；联合组细胞凋亡率高于DOX组；干扰组、DOX组、联合组Caspase-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平高于空白对照组，DOX组、联合组Caspase-3活性高于阴性对照组，干扰组、DOX组、联合组Caspase-9活性高于阴性对照组，联合组Caspase-3活性高于干扰组，DOX组、联合组Caspase-9活性高于干扰组，联合组Caspase-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平高于DOX组。提示在本实验体系中，线粒体在bcl-2沉默对人子宫内膜癌RL-952细胞凋亡的促进作用中发挥了关键作用。但由于癌细胞基因突变的多样性，靶向bcl-2 siRNA干扰序列在其他癌细胞中的作用仍有待进一步研究。

综上所述，靶向bcl-2 siRNA干扰序列可以有效增强子宫内膜癌RL-952细胞对化疗药物DOX的敏感性。因此，bcl-2基因沉默结合传统DOX化疗可能在人子宫内膜癌的治疗中具有广泛的应用前景。随着siRNA相关技术研究的深入，siRNA药物在不久后将会进行临床试验，从而给肿瘤的临床治疗开辟一条新的途径。

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(本文编辑：崔丽红)

Influence of bcl-2 Small Interference RNA on the Sensibility of Endometrial Carcinoma RL-952 Cells to Doxorubicin

ZHOUFu-qun,HUANGZhang-qian,HEYao.

DepartmentofGynaecologyandObstetrics,ShaoxingWomen&Children′sHospital,Shaoxing312000,China

Objective To research the influence of bcl-2 targeting siRNA on the sensibility of endometrial carcinoma RL-952 cells to doxorubicin (DOX).Methods From May to August in 2014,siRNA interference sequence were transfected into endometrial carcinoma RL-952 cells.The RL-952 cells were divided into three trial groups: blank control group,bcl-2 siRNA interference group (with transfected bcl-2 siRNA interference sequence) and negative control group (with transfected siRNA empty sequence).The transfection efficiency of bcl-2 siRNA interference group and the protein expression level of bcl-2 of the three groups were tested.The RL-952 cells were divided into five groups: control blank group,negative control group (with transfected siRNA empty sequence),interference group (with transfected bcl-2 siRNA interference sequence),DOC group (added with 5 μg/ml DOX),and combination group (with transfected siRNA interference sequence and 5 μg/ml DOX).Cell viability,cell apoptosis rate,the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level of the five groups were tested.Results The efficiency of transfection from siRNA interference sequence to endometrial carcinoma RL-952 cells was (94.6±12.5)%.The three trial groups were significantly different in the protein expression level of bcl-2 (F=8.75,P<0.05).The bcl-2 siRNA interference group was lower than blank control group and negative control group in the protein expression level (q=3.99,2.87;P<0.01).The five groups were significantly different in cell viability (F=42.52,P<0.05).Interference group,DOC group and combination group were lower than blank control group in cell viability (q=7.66,8.64,6.89;P<0.05);combination group was lower than DOX group in cell viability (q=6.76,P<0.01).The five groups were significantly different in cell apoptosis rate (F=112.34,P<0.05).Interference group,DOX group and combination group were higher than blank control group in cell apoptosis rate (q=5.78,4.99,6.21;P<0.05);combination group was higher than DOX group in cell apoptosis rate (q=4.89,P<0.01).The five groups were significantly different in the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level (P<0.05).Interference group,DOX group and combination group were higher than the blank control group in the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level (P<0.05);DOX group,and combination group were higher than negative control group in the activity of Caspase-3 (P<0.05),and interference group,DOX group and combination group were higher than negative control gorup in the activity of Caspase-9 (P<0.05);combination group was higher than interference group in the activity of Caspase-3 (P<0.05),and DOX group and combination group were higher than interference group in the activity of Caspase-9 (P<0.05);combination group was higher than DOX group in the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level (P<0.05).Conclusion bcl-2 targeting siRNA interference sequence can increase the sensitivity of endometrial carcinoma RL-952 cells to DOX.bcl-2 gene may be a potential target in the gene therapy of endometrial carcinoma.

Endometrial neoplasms;Genes,bcl-2;RNA,small interfering;Doxorubicin;Cysteine proteases

312000 浙江省绍兴市妇幼保健院妇产科

周夫群，312000 浙江省绍兴市妇幼保健院妇产科；E-mail：zfqyst@163.com

R 737.33

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.24.010

2014-09-30；

2015-03-25)