甘蔗胚性愈伤高效诱导系列研究I.幼叶离体培养直接诱导胚性愈伤发生

李纯佳，徐超华，姚丽，覃伟，吴转娣，刘家勇

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远661699）

甘蔗胚性愈伤高效诱导系列研究I.幼叶离体培养直接诱导胚性愈伤发生

李纯佳，徐超华，姚丽，覃伟，吴转娣，刘家勇

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远661699）

以ROC22心叶为外植体，研究了取材部位、培养基蔗糖含量等因素对甘蔗胚性愈伤发生的影响，重点探讨了不同植物激素和生长调节剂组合的作用，建立了无需继代、直接诱导高质量甘蔗胚性愈伤发生的体系。结果表明：顶端生长点以上5～6 cm区段最内层3片心叶为最适外植体；MS+2，4-D 3.0 mg/L+ Dicamba 1.0 mg/L+6-BA 0.1mg/L+DA-6 6.0 mg/L+CSN 4.0mg/L+蔗糖40 g/L为最佳培养基；经28 d暗培养，心叶无需继代即可分化成为胚性愈伤，诱导率可达42.67%。所得胚性愈伤质量高、分化强，可用于甘蔗遗传转化研究。

甘蔗；胚性愈伤；无继代诱导；植物激素；植物生长调节剂

甘蔗（Saccharum officinarum L.）为禾本科甘蔗属经济作物，是我国重要的生物能源材料和最主要的食糖来源[1]。新良种的选育是甘蔗产业持续发展的基础。传统的杂交育种对甘蔗遗传改良贡献良多，但受到物种自身染色体结构复杂和品种遗传基础薄弱[1]等因素限制，传统方法越来越难以创造出新的优良品种。植物基因工程技术的发展为甘蔗品种改良提供了新的途径。各国甘蔗育种家成功运用分子育种技术创制了一批具有高糖[2]、抗虫[3]、抗病[4]、耐旱[5]等优良性状的基因工程材料，一些材料已形成品种并投入生产[6-7]。

甘蔗转基因以基因枪轰击法为主，农杆菌侵染法为辅[8]，胚性愈伤诱导均为其必要的前置技术环节。作为外源基因的直接受体，胚性愈伤诱导质量直接影响最终转化率的高低，诱导时间则在很大程度上决定了整个实验周期的长短。因此，胚性愈伤诱导体系是甘蔗转基因的重要基础。自1979年曾吉恕[9]报道了国内首例甘蔗组培体胚发生以来，我国研究者以不同基因型的商业种为材料，进行了大量甘蔗胚性愈伤诱导工作[10]。这些工作大多强调愈伤增殖与分化，显然更适用于蔗苗快繁。与组培育苗相比，转基因有着不同的侧重点和目的，对胚性愈伤判断标准、诱导质量、选择时期要求也更为严苛[11]，因此不宜简单套用育苗体系，而必须做出相应调整。无论是转基因育种还是组培快繁的诱导体系，甘蔗胚性愈伤往往需要经过多次继代才能获得[8，11]。这一过程不但耗时长、费工多，而且增加污染风险，对于转基因而言，更容易使愈伤表面胚性细胞团在继代培养中发育为成熟胚状体，从而增加转基因嵌合体的发生[12]。

本研究中，我们借鉴前人工作经验，以当前主栽品种ROC22为材料，使用几种较为新颖的植物生长调节剂，建立了特别适合遗传转化的甘蔗心叶外植体直接诱导胚性愈伤发生体系，以期为甘蔗生物育种提供便利，同时为甘蔗工厂化育苗、生物反应器等其他需要胚性愈伤参与的研究提供一定参考。

1 材料与方法

材料为ROC22的无性系，种植于云南省农业科学院甘蔗研究所第一科研基地。取供试植株顶端肥厚带以上叶鞘，以75%酒精擦拭消毒后于超净工作台内剥取最内层3片心叶。以MS培养基为基本培养基，添加8.0 g/L卡拉胶，高压灭菌前以1.0 mol/L NaOH或HCl调节至pH 5.8。所用植物生长调节物质包括：2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、莠去津（Dicamba）、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、氯吡苯脲（CPPU）、胺鲜脂（DA-6）、复硝酚钠（CSN），其配比与蔗糖用量见表2～5。心叶切成0.5 cm见方，叶背向上平铺于培养基上，每处理4皿，每皿接种25块，重复3次。愈伤诱导在黑暗的恒温培养箱内进行，温度设定为28±0.5℃。培养时间为40 d，接种后每4 d观察1次。

参照文献[8]和[10]，以颜色淡黄、质地紧实致密、表面光滑且具有隆突的愈伤为胚性愈伤。褐化率为发生褐化的外植体占接种外植体总数的百分比；胚性愈伤诱导率为胚性愈伤愈伤块数与接种外植体总数的百分比值，取40 d中出现的最高值；胚性愈伤形成时间为最高胚性愈伤诱导率首次出现的天数。

2 结果与分析

表1 不同部位外植体诱导愈伤的差异

2.1 甘蔗不同部位外植体愈伤诱导差异

ROC22顶端生长点以上5～8 cm范围内，心叶不同部位外植体的愈伤诱导情况存在差异（表1）。5～6 cm段表现最佳，在本试验中未见污染，褐化率0.33%亦为本试验中最低水平，其愈伤发生率达最高的96.00%；其次是6～7 cm段，此段外植体同样未见污染，其褐化率也较低，为8.33%，其愈伤发生率也高达89.67%；7～8 cm段三项数据均为最差，其污染率高达9.33%，褐化率达15.67%，愈伤发生率仅有72.67%。由此可见，心叶不同部位在离体培养中具有不同表现，顶端生长点以上5～6 cm段是外植体的最佳选择。

2.2 外源生长调节物质对甘蔗心叶胚性愈伤发生的影响

2.2.1 2，4-D和Dicamba及其配比的影响前人研究[13-15]表明，甘蔗心叶胚性愈伤诱导中2，4-D等生长素用量不宜超过4.0 mg/L。表2显示了这一总剂量下，2，4-D和Dicamba间不同配比诱导外植体胚性愈伤发生的情况。5个组合均成功诱导了心叶外植体的胚性愈伤发生，说明甘蔗心叶外植体具有直接形成胚性愈伤组织的能力，但发生率低下，难以满足实际应用需求。

本试验中，2，4-D和Dicamba搭配使用时褐化率较低、胚性愈伤发生率相对较高，效果优于各自单独使用，这提示了激素配合对甘蔗心叶胚性愈伤诱导具有一定协同作用。

2.2.2 细胞分裂素（CTK）的影响在只含有6-BA、KT、CPPU等CTK的MS培养基上，外植体褐化严重，愈伤体积膨大，质地松散，呈胶状或水渍状，质量较差，说明只使用CTK难以诱导出胚性愈伤。与2，4-D、Dicamba配合使用时，CTK对ROC22心叶胚性愈伤诱导影响巨大，如表3所示。

与对照（B-1）相比，含有CTK的培养基上外植体褐化率显著提高。KT褐化率较低（12.67%～17.33%），6-BA居中（16.67%～36.00%），CPPU最高（34.33%～65.33%）。这一排序与三者的生物活性一致。同时，各CTK引起的外植体褐化又随使用浓度的提高而加剧，0.1 mg/L KT最低，为12.67%，而0.5 mg/L CPPU最高，高达65.33%。

表2 2,4-D和Di c amba不同配比诱导外植体胚性愈伤发生

表3 细胞分裂素对甘蔗心叶胚性愈伤诱导的影响

表4 DA-6对甘蔗心叶胚性愈伤诱导的影响

3个浓度水平下，CPPU仅在用量为0.1 mg/L时显示了轻微的促进作用，综合表现较差，不宜选用。低浓度（0.1、0.2 mg/L）6-BA和高浓度（0.5 mg/ L）KT对胚性愈伤发生的促进作用比较明显。三者胚性愈伤发生率均为本试验最高的24.67%，但培养过程中发现，KT耗时较长，胚性愈伤易老化，甚至偶有白化小叶分化形成。综上认为0.1或0.2 mg/L 6-BA是较为适宜的选择。

2.2.3 DA-6的影响在只含有DA-6的MS培养基上，外植体分化缓慢，愈伤发生率低，未获得胚性愈伤，说明DA-6不能替代外源激素，或者对外源激素的替代作用十分有限。但从表4可以看出，DA-6与外源植物激素搭配使用对甘蔗胚性愈伤发生具有很好的诱导效果。

未使用6-BA时，2.0～10.0mg/L的DA-6均可促进胚性愈伤发生，同时未引起褐化加剧。6-BA加入后，DA-6正向作用浓度范围被缩小至2.0～6.0mg/L，此时，DA-6抗外植体褐化、促胚性愈伤发生的功效随用量升高而加强，并在6.0 mg/L处达到顶点。与0.1mg/L 6-BA合用时（C-10培养基），获得了36.00%的最高胚性愈伤发生率，而褐化率仅为9.33%。继续提高DA-6浓度并不能取得更好的效果，8.0和10.0mg/L浓度下仅取得了与对照（C-7、C-13）大致相当或劣于对照的效果。

可见，DA-6在抑制外植体褐化、促进胚性愈伤发生等两方面具有积极作用，其作用效果随使用浓度增加呈现较为一致的拐点效应，不高于6.0mg/L的用量可取得较好的效果。培养过程中观察发现，含有DA-6的培养基上，外植体分化减缓，但愈伤质量普遍较好，这些高质量愈伤表面陆续产生隆突，成为胚性愈伤，从而使胚性愈伤形成时间有所延长。

表5 蔗糖浓度和CSN对甘蔗心叶胚性愈伤发生的影响

2.2.4 蔗糖浓度和CSN的影响如表5所示，蔗糖的不同浓度对外植体褐化率和胚性愈伤发生率几乎没有影响，但蔗糖浓度为40 g/L的培养基上，愈伤体积较小、质地紧实、颜色嫩黄，质量较高，胚性愈伤形成时间也略有缩短。

CSN对甘蔗心叶胚性愈伤诱导具有双重积极作用，可在提高胚性愈伤发生率的同时大幅提高诱导效率。表5显示，外植体胚性愈伤发生率随CSN用量先升后降，并在4.0 mg/L时达到最高，为42.67%。在此浓度下，外植体分化缓慢的情况得以充分解除，大量高质量愈伤在较短时间内集中转化为胚性愈伤，从而极大提前了胚性愈伤出现的时间。

2.3 胚性愈伤分化

按照本文标准选择的胚性愈伤具有极强的分化能力，甚至可在不含任何激素的MS空白培养基上100%分化成苗，但添加适量CTK更有利于愈伤分化。经约2周的光照培养，胚性愈伤性状发生变化，颜色由淡黄或乳白完全变为白色，胞质浓郁，表面干湿适中且有光泽，隆突变为粗糙颗粒，进而有绿色芽点分化出现。随着培养时间的延长，愈伤表面芽点增多，并进一步发育形成心形心叶；胚性愈伤分化率不断提高，最终可达100%。总体而言，所得胚性愈伤分化十分容易，可不依赖外源激素而自行成苗。

3 结论与讨论

甘蔗心叶离体培养过程中，部分高质量的紧致愈伤表面产生了光滑的隆突。具有这种形态特征的愈伤分化再生能力极强，外源激素已不再是其分化成苗的必要条件。这是一般的愈伤组织难以企及的。澳大利亚8个主栽品种经诱导均得到了这种胚性愈伤[11]，说明这种愈伤形态特征并非ROC22独有，而在甘蔗中普遍存在。组织学观察[16]和遗传转化实验[8，11]结果均显示这种愈伤适用于转基因育种。我们认为可以将隆突的有无作为甘蔗胚性愈伤的判别标准。

外源激素和植物生长调节剂的搭配使用提高了胚性愈伤诱导率，不同生长调节物质间对甘蔗胚性愈伤发生具有十分明显的协同促进作用。这一结果与崔广荣等在文心兰[17-18]和蝴蝶兰[19]组培研究中得出的细胞分裂素间具有“加性效应”理论一致，并可作为前者的拓展与补充。DA-6和CSN均为新型植物生长调节剂。DA-6可平衡植物细胞体内各激素配比[20-21]，CSN是一种植物细胞赋活剂[22-23]。二者在植物组织培养中的应用，目前仅限于诱导余甘子离体不定芽生根[24]。我们首次将其应用于植物胚性愈伤诱导，发现二者具有促进甘蔗胚性愈伤发生、抑制外植体褐化、缩短诱导时间的功效。以上结果提示了多种植物生长调节剂间互相搭配的强大功效，但其最优组合尚需进一步试验探寻。

综上，我们建立了无需继代的甘蔗胚性愈伤诱导体系。以ROC22顶端生长点以上5～6 cm区段内最内层3片心叶为外植体，在MS+2，4-D 3.0 mg/L+Dicamba 1.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+DA-6 6.0 mg/L+CSN 4.0 mg/L+蔗糖40 g/L培养基上，经28 d暗培养，外植体可不经继代、直接分化成为胚性愈伤，诱导率可达42.67%。所得胚性愈伤分化再生能力极强，具有在空白培养基上自行成苗的能力，可满足甘蔗生物技术育种、育苗的相关需求。

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A Serial Studies on High-efficiency Induction for Sugarcane Embryonic Callus I.Vitro Direct Induction of Embryonic Callus in Sugarcane Leaf Exp lants

LIChun-jia,XU Chao-hua,YAO Li,QINWei,WU Zhuan-di,LIU Jia-yong
(Yunnan Sugarcane Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences; Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement,Kaiyuan 661699)

Direct and subculture-free induction system for high-quality embryonic callus of sugarcane was established with furled young leaves of ROC22 sectioned as explants,and effects of different parts of young leaves,sucrose content ofmedium,especially the combination of various phytohormone and growth regulators to induction rate were investigated.The results showed that longitudinal region between 5 to 6 cm above the apical meristem of inner 3 leaveswas optimal as explant;MSmedium with 2,4-D 3.0 mg/L+Dicamba 1.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+DA-6 6.0 mg/L+CSN 4.0mg/L+Sucrose 40 g/L was screened to be as the optimum.After treating 28 d of darkness and non-subculture,the explants could be directly inducted into embryonic callus rate up to 42.67%.Thus the embryonic callus of high quality and strong ability of regeneration from the subculture-free induction system was particularly suitable for sugarcane gene-transfer.

sugarcane;embryonic callus;subculture-free induction;phytohormone;plantgrowth regulator

S566.103

A

1007－2624（2015）01－0001－04

10.13570/j.cnki.scc.2015.01.001

2014-12-25

云南省农业科学院甘蔗品种改良与应用省创新团队（2014HC015）；云南甘蔗杂交花穗规模化生产与抗旱新品种选育及示范（2014RA059）；云南省技术创新人才培养对象（2014HB058）。

李纯佳（1985-），男，湖北省十堰人，硕士，研究实习员，研究方向：甘蔗分子生理学，E-mail：welsper@126.com。

刘家勇（1976-），男，研究员，研究方向：甘蔗遗传育种，E-mail：lljjyy1976@163.com。