β-catenin蛋白在紫杉醇治疗宫颈癌中表达的研究

黄彤辉

南华大学附属南华医院妇产科，湖南省衡阳市　421002

β-catenin蛋白在紫杉醇治疗宫颈癌中表达的研究

黄彤辉

南华大学附属南华医院妇产科，湖南省衡阳市421002

摘要目的：本研究通过检测β-catenin蛋白在紫杉醇治疗宫颈癌过程中的表达, 探讨wnt/β-catenin信号通路在紫杉醇治疗宫颈癌中的作用机制。方法：MTT 比色法检测不同浓度紫杉醇对人宫颈癌Caski细胞株增殖的影响，计算抑制率及IC50，对照组未予紫杉醇处理，而实验组则加入紫杉醇(IC50终浓度)，采用细胞免疫组织化学法检测两组Caski细胞β-catenin 蛋白表达。结果：采用不同紫杉醇溶液浓度分别作用Caski细胞24h、48h及72h后，通过MTT比色法检测结果显示对细胞的抑制作用随药物浓度的增加而增强，IC50值由IC50专用计算软件求得IC50=(6.04±1.70)nmol/L。实验组和对照组β-catenin蛋白于胞浆胞核中均有表达，实验组β-catenin蛋白表达阳性率为39.3%，对照组β-catenin蛋白表达阳性率为71.7%，实验组中阳性率明显减少(P<0.05)。紫杉醇对Caski细胞增殖的影响呈剂量效应和时间效应关系。实验组β-catenin蛋白表达阳性率为39.3%，对照组β-catenin蛋白表达阳性率为71.7%，实验组中阳性率明显减少(P<0.05)。结论：单纯应用一定浓度的紫杉醇均能抑制Caski细胞的增殖。紫杉醇能够抑制宫颈癌Caski细胞内β-catenin 蛋白表达，呈浓度依赖性，从而阻断wnt/β-catenin信号传导通路，同时影响癌基因表达，进而诱导宫颈癌Caski细胞的凋亡。

关键词紫杉醇β-catenin蛋白wnt/β-catenin信号通路

The Study on Expression of β-catenin Protein after Paclitaxel on Cervical Cancer

HUANG Tonghui.AffiliatedNanhuaHospital,UniversityofSouthChina,HengyangCity，Hu’nanProvince421002

ABSTRACT Objective:In this study, the core protein expression changes of wnt/β-catenin signaling pathway detected from protein levels after paclitaxel on Caski cells, and then exploring the mechanism of the wnt/β-catenin signaling pathway in the course of paclitaxel treatment of cervical cancer.Methods:To detect with different density of paclitaxel on the proliferation of human cervical carcinoma Caski cell by MTT colorimetric assay. Calculated inhibition ratio and IC50.Experimental group added paclitaxel. Control group were not treated incubator.β-catenin protein expression were detected by immunohistochemistry.Results:The inhibitory effect on the cell increase while the drug concentration increased. In experimental group, the positive rate was 39.3%. In control group, the positive rate was 71.7%. The positive rate in experimental group was significantly decreased (P<0.05).Conclusion:The effect of Paclitaxel inhibiting Caski cell is exact. Application of a certain concentration of paclitaxel merely can inhibit the proliferation of Caski cells. Paclitaxel can inhibit the expression of β-catenin protein in cervical cancer Caski cells,thereby blocking the wnt/ β -catenin signal transduction pathway, and inducing apoptosis of cervical cancer Caski cell.

KEY WORDS Paclitaxel,β-catenin, wnt/β-catenin signaling pathway

1材料与方法

1.1宫颈癌细胞株的建立人宫颈癌Caski细胞株由南华大学生物学研究所实验室传代保存。用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养人宫颈癌Caski细胞，取80%~90%对数生长期且生长至铺满培养瓶的细胞用于实验。

1.2MTT比色法检测不同浓度紫杉醇对人宫颈癌Caski细胞株增殖的影响细胞贴壁约2h后加入不同浓度紫杉醇溶液各100μl，各实验组紫杉醇溶液的浓度分别为0.001μg/ml、0.010μg/ml、0.100μg/ml、1.000μg/ml、10.000μg/ml、100.000μg/ml、1 000.000μg/ml。每种浓度设5个复孔。对照组为新鲜培养液(含 10%的胎牛血清)。每孔加入0.5%噻唑蓝溶液20μl，继续培养约4h。加入含胎牛血清的新鲜培养基终止培养， 每孔加入250μl二甲基亚砜溶液，测量各孔的吸光值(OD)：计数抑制率及IC50值；以空白调零计算细胞增殖抑制率(%)=[1- (实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%；IC50值由IC50专用计算软件求得。所有实验重复3次，每组至少设置5个副孔。

1.3细胞免疫组化法观察β-catenin蛋白在人宫颈癌Caski细胞中的表达滴加正常山羊血清工作液1~2 滴(将细胞覆盖完)，37℃孵育 30min， 滴加一抗(兔抗人β-catenin 单克隆抗体25μg/ml)置 4℃冰箱孵化过夜，以磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照，置4℃冰箱过夜。 生物素标记二抗，滴加过氧化物酶(辣根过氧化物酶)约 2 滴，37℃温箱中孵育 15min，DAB 显色， 苏木素复染1min，封片，置镜下观察。

1.4显微镜下图像判断标准观察染色结果：以在胞浆、细胞核和(或)胞膜内出现棕褐色细小颗粒为本实验中β-catenin蛋白的阳性表达。高倍镜(×400)下根据细胞的染色强度和阳性细胞的计数进行半定量分析。评分标准如下：A染色强度：3分为黄褐色，2分为棕黄色，1分为淡黄色，0分为不着色；B计数标准：以序列方式随机选取20个高倍视野(×400)，每个视野中(从左至右，从上至下)计数100个完整的肿瘤细胞。判定标准：按照着色细胞的百分率记分，分为0~4分(其中0分为<5%， 1分为5%~25%， 2分为26%~50%， 3分为50%~75%， 4分为>75%)。

2结果

2.1不同浓度紫杉醇对宫颈癌Caski细胞株增殖的影响本实验采用不同浓度紫杉醇溶液分别作用Caski细胞24h、48h及72h后，通过MTT比色法检测结果显示，对细胞的抑制作用随药物浓度的增加而增强，随药物作用的时间延长而增强。单纯应用某一浓度的紫杉醇均能抑制Caski细胞的增殖，其对增殖的影响呈剂量效应和时间效应关系。IC50=(6.04±1.70)nmol/L。见图1和表1。

不同浓度紫杉醇(μg/ml)

图1不同浓度紫杉醇对宫颈癌Caski细胞增殖的影响

2.2紫杉醇对β-catenin蛋白在Caski细胞中表达的影响实验组和对照组β-catenin蛋白于胞浆、细胞核和(或)胞膜内中均有表达(见图2、3)，对照组

wnt/β-catenin途径的异常激活是宫颈癌重要的发病机制[1]，可以通过检测β-catenin的表达水平来判断wnt/β-catenin信号通路的激活水平。wnt/β-catenin信号通路在紫杉醇治疗宫颈癌中的作用机制目前尚不明确，因此, 探讨紫杉醇治疗宫颈癌过程中对wnt/β-catenin信号通路的影响对临床将有重要的指导意义。本研究以不同浓度紫杉醇对宫颈癌Caski细胞株增殖的影响为立足点，用免疫组化法检测wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin蛋白表达，以研究紫杉醇对宫颈癌肿瘤细胞wnt/β-catenin信号通路的影响，进而探索该信号通路在紫杉醇抗肿瘤作用中的具体机制。

表1　紫杉醇对宫颈癌Caski细胞抑制

注：同一组与24h时间组段相比较P<0.05；同一时间与0.001μg/ml浓度相比较P<0.05。

棕黄色颗粒者更致密，呈团块状。实验组阳性率为39.3%，对照组阳性率为71.7%。实验组中β-catenin蛋白表达阳性率明显减少(P<0.05)。

图2对照组Caski细胞中图3紫杉醇作用后Caski细胞中

β-catenin蛋白(s-p法×400)β-catenin蛋白(s-p法 ×400)

3讨论

紫杉醇类属于细胞周期特异性药物，其药理机制主要是通过结合到微管蛋白上，阻滞其解聚成亚单位，并促进微管蛋白的聚合，在妇科恶性肿瘤治疗中起着越来越重要的作用[2]。随着分子生物学技术在恶性肿瘤基础研究中的应用，发现肿瘤的形成发展过程中，越来越多的基因及信号通路参与其中，其中wnt/β-catenin通路便是研究的热点之一。wnt/β-catenin信号通路在促进及维持肿瘤干细胞的增殖、成瘤性、耐药性等诸多方面起着重要作用，该作用在白血病、淋巴癌、皮肤癌等肿瘤中已被证实[3]。β-catenin蛋白是一种多功能蛋白，是wnt/β-catenin信号传导通路的核心元件，其充当转录因子作用，在细胞核内启动并激活促使细胞分裂的基因，其介导的wnt/β-catenin信号传导通路异常激活在多种恶性肿瘤的发生发展过程中起重要作用[4]。

目前关于紫杉醇对wnt/β-catenin信号传导通路的作用机理尚不明确，因此检测β-catenin蛋白的异常表达情况可帮助判断wnt/β-catenin信号通路在紫杉醇治疗宫颈癌过程中的可能作用机制。本实验采用不同浓度紫杉醇溶液分别作用Caski细胞24h、48h及72h，通过MTT比色法检测宫颈癌Caski细胞凋亡情况，实验结果显示，不同浓度紫杉醇均能造成Caski细胞的凋亡，其对增殖的影响呈剂量效应和时间效应关系。紫杉醇实验组β-catenin蛋白表达水平在Caski细胞中表达明显下降。本实验揭示了紫杉醇作用Caski细胞的可能机制：紫杉醇导致Caski细胞内β-catenin蛋白水平下降，

使wnt/β-catenin信号通路中关键的信号介质减少，进而使信号传递过程中断受阻，进而影响Caski细胞的继续增殖，诱导细胞凋亡。尽管本实验对紫杉醇药物影响wnt/β-catenin信号传导通路具体分子学机制未做相关阐述，但为进一步探讨紫杉醇药物调控肿瘤信号传导通路提供了基础。

参考文献

[1]Pectasides D,Kamosioras K,Papaxoinis G,etal.Chemotherapy for recurrent cervicalcancer〔J〕. Cancer Treatment Reviews,2008,34(7):603-613.

[2]Van den Bent MJ，Hegi ME，Stupp R. Recent developments in the use of chemotherapy in brain tumours〔J〕. Eur J Cancer,2006,42(5):582-588.

[3]Kestler HA,Kuhl M.From individual Wnt Pathways towards a Wnt signaling Network〔J〕.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2008，363(1495):1333-1347.

[4]Garcia AA,Blessing JA,Vaccarello L,etal.Gynecologic oncology group study.phase ii clinical trial of docetaxel in refractory squamous cell carcinoma of the cervix:a gynecologic oncology group study〔J〕.Am J Clin Oncol,2007,30(4):428-431.

(编辑落落)

收稿日期2014-10-13

中图分类号：R737.33

文献标识码：A

文章编号：1001-7585(2015)03-0305-03