乙肝病毒血清标志物与其DNA检测结果对比分析及临床意义

冯　佳

四川省南充市中心医院　637000

乙肝病毒血清标志物与其DNA检测结果对比分析及临床意义

冯佳

四川省南充市中心医院637000

摘要目的：比较乙肝血清不同模式标志物与HBV-DNA结果进行对比分析，探讨二者之间的关系及临床意义。方法：收集2012年8月-2013年3月乙肝患者标本548例，采用酶联免疫方法和实时荧光定量PCR方法分别检测乙肝病毒血清标记物和病毒DNA，比较它们之间的关系。结果：HBsAg阳性组共514例，HBV-DNA定量小于1×103copies/L(阴性)共244例，HBV-DNA定量大于1×103copies/L(阳性)共270例，HBV-DNA对数值为(5.31±1.74)；HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组共118例,HBV-DNA对数值为(7.03±1.01)；HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组共260例，HBV-DNA定量阳性共111例，其对数值为(4.21±1.20)，HBV-DNA定量阴性共149例；HBsAg、HBcAb阳性组共116例，HBV-DNA定量阴性共70例，HBV-DNA定量阳性共46例，其对数值为(4.90±1.66)；其他标志物模式组共34例，HBV-DNA定量阴性。HBV-DNA对数值在HBeAg阳性组与HBeAb阳性组间相比，有显著的统计学差异(P<0.05)。Real-time PCR法和ELISA法诊断乙肝的敏感性分别为49.3%和93.8%，符合率为55.5%。结论：Real-time PCR法和ELISA法在HBeAg阳性组有良好的相关性，两种方法分别检测乙肝病毒感染机体不同状态，它们之间能互为补充，不能相互替代。

关键词乙肝标志物HBV-DNA酶联免疫反应实时荧光定量PCR

Comparison and Clinical Significance of Quantitative Fluorescent Detection of HBV-DNA and the Results of Serum Marker

FENG Jia.NanchongCentralHospital,NanchongCity,SichuanProvince637000

ABSTRACT Objective:To compare the results of quantitative fluorescent detection of HBV-DNA with the HBV serum marker and explore the relationship and clinical significance.Methods:548 serum samples of HBV patients were collected from August 2012 to March 2013，all samples were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction(Real-time PCR)at the same time,then the results of serum markers of hepatitis B virus and viral DNA were analyzed.Results:There were 514 patients in the group of HBsAg(+)，the positive patients of HBV-DNA in the group of HBsAg(+)were 270 and the average logarithmic value was(5.31±1.74).The patients in the group of HBsAg(+), HBeAg(+), HBcAb(+)were 118 and the positive patients of HBV-DNA were 118，the average logarithmic value was(7.03±1.01).The patients in the group of HBsAg(+), HBeAb(+), HBcAb(+)were 260 and the positive patients of HBV-DNA were 111，the average logarithmic value was(4.21±1.20).The patients in the group of HBsAg(+),HBcAb(+)were 116 and the positive patients were 46，the average logarithmic value was(4.90±1.66).The patients of the other group were 34 and the quantitative detection of HBV-DNA was negative. The diagnostic sensitivity of Real-time PCR and ELISA was 49.3% and 93.8% respectively, the coincidence rate of those two methods was 55.5%.Conclusion:There is a good correlation between Real-time PCR and ELISA,and the results of HBV patients detected by those two methods reflect the different states of hepatitis B infection.These two methods can complement each other and not substitute for each other.

KEY WORDS HBV marker，HBV-DNA，ELISA，Real-time PCR

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是一个全球性严重的公共卫生问题。据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)报道，全球60亿人口中，约20亿人曾感染过HBV，其中4.0亿人为慢性HBV感染，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌[1]。因此，乙肝病毒检测对乙肝的诊断、治疗和预后极为重要。随着免疫学和分子生物技术的迅速发展，检测乙肝病毒标志物的方法不断更新。目前临床使用的主要方法有酶联免疫吸附测定法和分子诊断技术中的实时荧光定量PCR法。本文对548例乙肝患者的乙肝免疫学标志物与HBV-DNA定量的检测结果进行了实验对比分析，探讨二者之间的关系及临床意义。

1资料和方法

1.1病例资料548例乙肝患者均来自2012年8月-2013年3月来我院就诊的门诊及住院乙肝患者，病程超过1年以上，其中男373例，女175例，年龄最大86岁，最小6岁，平均年龄(37.6±16.6)岁。乙型肝炎诊断标准按《乙型病毒性肝炎诊断标准(WS299-2008)》执行。

1.2仪器与试剂HBV-DNA检测系统包含实时荧光定量PCR仪、乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、校准品、操作程序、数据处理软件来自于上海科华生物工程股份有限公司，质控品为本实验室按文献方法自制[2,3]；酶联免疫检测系统包含酶标仪、乙型肝炎病毒诊断试剂盒(五项)、洗板机、操作程序、数据处理软件来自于上海科华生物工程股份有限公司，质控品为卫生部临床检验中心。所有的仪器和检测项目操作均按本室制定SOP文件执行，所有检测项目室内质控在控。

1.3方法血清标本的采集与处理：HBV-DNA标本采集采用灭菌的一次性真空带盖塑料管，清晨空腹抽取静脉血3~5ml，离心分离血清分装于1.5ml灭菌EP管，保存于-20℃冰箱备用，1周内完成实时荧光定量PCR；HBV血清标志物标本采集采用一次性真空带盖塑料管，清晨空腹抽取静脉血3~5ml，离心分离血清后当天完成ELISA检测。

1.4数据处理HBV-DNA定量以大于1×103copies/L为判断阳性的标准，小于1×103copies/L为阴性；ELISA方法cut off值按试剂盒操作说明书设置并验证。计量资料用均值±标准差形式，结果比较采用t检验。

2结果

2.1HBV感染血清标志物主要组合模式与HBV-DNA定量阳性结果的比较见表1。A组表示HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组；B组表示HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组；C组表示HBsAg、HBcAb阳性组；D组表示HBsAg阴性(其他标志物阳性)组；E组表示HBsAg阳性组(其他标志物可能阳性)

表1　HBV感染血清标志物主要组合模式与

注：*：表示A组与B组比较；△表示A组与C组比较；#表示A组与E组比较。

2.2548例乙肝患者以HBsAg阳性和阴性进行分组，分析两种检测方法的符合率和敏感性，具体数据见表2。

表2　两种方法诊断乙肝患者的符合率和敏感性比较

3讨论

乙肝病毒血清标志物是目前诊断乙型肝炎最常用的指标，包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb五项指标，主要反映人体对乙肝病毒的免疫反应状态。检测乙肝血清标志物的免疫学方法中最常用的是酶联免疫吸附测定法(ELISA)，该法灵敏度较高，可达到纳克水平，如引入生物素和亲和素系统或采用化学发光等技术，其灵敏度还可进一步提高。不同血清免疫学标志物代表不同的临床意义，如HBsAg是乙肝病毒感染的特异性标志，阳性常见于急性乙肝的潜伏期、急性期及慢性乙肝病毒感染状态。HBeAg其阳性和滴度可反映乙肝病毒的复制情况及传染性的强弱等。

实时定量PCR是目前临床检测HBV-DNA的分子生物学方法，既保持了PCR技术灵敏与快速的特点，又克服了以往传统PCR的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点，其重复性好但检测过程较复杂而且费用较高。HBV-DNA阳性代表有完整的乙肝病毒颗粒的复制，被认为是衡量乙肝病毒复制有无及高低最灵敏、最精确与最直接的证据。

本文在两种方法同时检测乙肝患者血清发现(表1)，HBV-DNA在HBV血清学标志物阳性的各种模式中的检出率不一样，HBeAg阳性组(A组)HBV-DNA检出率为100%，其HBV-DNA平均含量约为107copies/ml，平均水平对数值为7.03；HBeAg阴性组(HBsAg阳性，B、C组)HBV-DNA检出率为41.8%，其HBV-DNA平均含量约为2.63×104copies/ml，平均水平对数值为4.42；与HBeAg阳性组相比有显著的统计学差异(P<0.05)。这组数据表明，HBeAg阳性组患者体内存在HBV病毒复制，有大量的病毒颗粒释放入外周血中；HBeAg阴性组(HBsAg阳性，B、C组)通常HBeAg 向HBeAb 的转换被认为是肝细胞中活跃复制病毒的清除期, 但仍能检出HBV-DNA ,这可能是编码HBeAg所在C区因发生突变时HBeAg 不能表达, 而HBV-DNA 不断复制的结果[4]，可表现为HBeAg阴性，但HBV-DNA为阳性。用定量PCR 技术检测慢性乙肝患者血清HBV-DNA含量表明: HBeAb 出现并不能表示HBV 复制的停止, 而只是复制水平的降低。 因此, 对HBeAb 阳性, DNA 也阳性者要慎重对待，这些乙肝病毒变异株与重型肝炎或肝炎慢性恶化有着极大关联。同时有研究表明研究证实，亚洲人平均50%的HBeAg阴性的慢性乙肝患者存在前C区突变[5]，即前C区G1896 A变异，导致终止密码子TAG改变，不能编码HBeAg；C区启动子A1762 T和G1764 A的双变异，前C区mRNA的产生减少，使HBeAg分泌减少。因此单以HBeAg作为乙肝病毒复制活跃与否的指标是不够的[5]。此外，两种方法在诊断乙肝的敏感性也存在较大差异，ELISA方法的特异性是93.8%，而FQ-PCR诊断乙肝的敏感性为49.3%，二者的符合率55.5%。这主要是因为FQ-PCR主要是通过检测HBV病毒DNA，准确地反映体内病毒的复制情况，对乙肝治疗方案的选择和疗效观察有较大的指导意义，而ELISA方法检测血清标志物主要是反映患者感染乙肝后免疫学状态，由于受到基因突变、免疫耐受及方法学检测敏感性等方面的影响，它还不能完全反映病毒颗粒在体内的复制情况，除非增加新的血清标志物，如前S1抗原等[6]。此外，在本次实验中亦出现乙肝五项标志物全部阴性者27例, PCR 方法检出2例DNA( + ) , 阳性率为7.4%, 这是由于HBV-DNA 的出现早于其他血清学指标[7], 受检者可能处于感染早期。

传统乙肝血清标志物由于其价格低廉、操作简便、诊断乙肝的敏感性较高等特点，临床上把它作为我国实验室乙肝检测与筛查时的主要选择指标。实时荧光定量PCR的临床应用使乙肝病毒的量化上了一个新的台阶，虽然其存在检测费用较高、检测过程复杂、在多数实验室尚不能普及规范检测等缺点，但许多资料表明,只要有HBV-DNA 就可以引起HBV感染 , 这不仅有诊断意义, 而且也有流行病学意义。其在临床治疗方案选择和药物疗效评价上也有不可比拟的优势。因此，这两种方法不能相互取代，可联合检测对乙肝临床诊断、治疗方案评估及疗效观察提供较客观的临床意义。

参考文献

[1]刘友德.山东地区HBeAg阴性慢性乙肝和肝硬化构成比和抗病毒治疗状况的变迁及病毒基因型分析〔D〕.济南：山东大学，2008.

[2]曹季军，吕心路，许爱萍，等.乙型肝炎病毒DNA定量检测临界室内质控品的制备与初步应用〔J〕.检验医学与临床，2011，22(8)：2271-2273.

[3]杨继明.乙肝抗原、抗体免疫测定室内质控品的制备及使用〔J〕.实验与检验医学杂志，2009，27(2)：201-202.

[4]王爱莲，周永兴，姚志强，等. 乙型肝炎病毒前C区基因变异的研究〔J〕.中华医学杂志，1994，74(1): 64-65.

[5]Funk ML,Rosenberg DM,etal.World-wide epidemiology of HBeAg-negative chronic hepatitis B and associated precore and core promoter variants〔J〕.J Viral Hepat,2002,9(1):52.

[6]李琴，孙桂珍，魏玉香，等.Pre-S1蛋白与乙肝病毒DNA 和e抗原在诊断乙肝病毒复制时的对比性研究〔J〕.中华肝脏病杂志，2004，12(3)：134-136

[7]王平忠，周永兴.HBV-DNA与HBV-M检测结果的对比分析〔J〕.中华实验和临床病毒学杂志,1999,13(4)：344.

(编辑羽飞)

收稿日期2014-09-04

中图分类号：R446；R512.6+2

文献标识码：A

文章编号：1001-7585(2015)03-0298-03