BOD 微生物传感器关键技术及其发展*

李一锦，夏善红

(1.中国科学院 电子学研究所 传感技术国家重点实验室，北京100190;2.中国科学院大学，北京100049)

0 引 言

近年来，随着工业废水、生活污水等的大量排放，水污染情况日益严重。我国制定了GB 3838—2002《地表水环境质量标准》，将水质分为5 类。水质分类指标主要包括化学需氧量(COD)、五日生化需氧量(BOD5)、氨氮、总磷、总氮等。其中，生化需氧量(BOD)是指在规定条件下，微生物分解水中某些可氧化物质，特别是有机物所进行的生物化学过程中所消耗的溶解氧的量［1］。BOD 是表征水中有机物含量的一项重要指标，其值越大，水中有机污染物含量越多，污染越严重。我国规定的标准检测方法为BOD5，即水样充满完全密闭的溶解氧瓶中，在(20±1)℃的暗处培养5 d±4 h 或(2+5)d±4 h，分别测定培养前后水样中溶解氧的量，由2 次测量的差值计算每升样品消耗的溶解氧。该方法存在测定精度低、重现性差、耗时长及操作繁琐等缺点，不适于BOD 的快速在线监测。测压法［2］、检压库仑法操作过程简便，但不能缩短培养周期;活性污泥曝气法准确度高，分析过程简便，但由于曝气过程中培养瓶内的空气流量不易控制，不具有普遍适用性。

1977 年，Karube I 等人［3］首次提出将从土壤中分离出来的微生物固定在胶原蛋白膜上，并与氧电极组成微生物传感器，检测废水BOD。该方法实现了BOD 的快速测定(1 h 以内)，简化了操作步骤，但其输出信号仅能在10 d 内保持稳定。此后，很多科学工作者对BOD 快速测定进行了研究［4～10］。

本文阐述了BOD 微生物传感器制备中选取微生物、固定微生物和选取换能器等关键技术，分析了不同方法的特点;分别对构成BOD 检测系统的各个部分进行了总结;讨论了目前BOD 微生物传感器研究中存在的问题，并对其研究发展趋势进行展望。

1 BOD 微生物传感关键技术

BOD 微生物传感器一般由两部分组成:生物识别元件和转换元件。生物识别元件是利用微生物的生化反应对待测底物进行识别响应的部分，一般分为微生物的选取和培养以及微生物固定两个步骤。转换元件是将生物响应信号转换成可测电信号、光信号等的部分。

1.1 微生物的选取和培养

BOD 微生物传感器中，所选微生物需要具有广谱性(即对待测底物的低选择性)、稳定性、无毒和对环境的耐受性等。一般作为生物识别元件的微生物可以是单一菌种、菌群、死细胞或酶等。

单一菌种作生物识别元件的微生物传感器具有长期稳定性好、信号重现性好等优点，但由于其代谢能力有限，一般只能检测特定类型的废水。常用于单一菌种检测的微生物包括皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)［4］，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)［5］，大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)［6］，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)［7，8］等。Arlyapov V 等人［9，10］发现C.maltosa，C.blankii，和D.hansenii 三种微生物均具有对水中有机物的氧化能力。其中，D.hansenii对实验中的34 种有机物均具有较好的降解能力，利用其制备的BOD 传感器检测范围可达0.7 ～207 mg/L。

由菌群构成的微生物传感器一般广谱性好，能实现多种有机物的快速降解，但由于多种微生物之间存在竞争或捕食关系，传感器的稳定性和重现性较差。Kumlanghan A等人［11］利用从橡胶工业废水中分离出的活性污泥作为生物识别元件制备BOD 微生物传感器，可实现橡胶工业废水的在线和离线检测，线性范围5 ～60 mg/L，可稳定测量15 d(每日测量3 次)，稳定性标准偏差±8.3%。为了利用菌群的广谱性，同时保持系统的稳定性，研究人员利用流动注射系统进行检测。Liu Jing 等人［11］选用菌群作为生物识别元件实现BOD 在线监测，检测线性范围为5 ～700 mg/L。通过注射新的菌糊进行微生物的更新而不用分解传感器系统，微生物可日更新，更新后24 h 内传感器响应的标准偏差仅为±2.4%。

死细胞作为生物识别元件，可批量加工、长期储存，其酶系统受细胞壁的保护而免于失活或中毒，尽管已失去自修复和再生能力，其也能保持良好的活性和稳定性。Tan T C 等人［13］应用加热到280 ℃并真空干燥2.5 min 得到的B.subtilis 死细胞制备的BOD 微生物传感器，其线性范围和重复性等均与固定活体微生物的结果类似。相比之下，虽然该传感器的灵敏度较低，恢复时间较长，但其稳定性可维持140 d(含400 次测量)。Kim Mal Nam 等人［14］利用酶和微生物共同作为生物识别元件，固定Klebsiella sp.后，再固定相应的多糖酶，从而提高传感器对相应多糖的响应和BOD的检测灵敏度。选定菌种后，还需选择合适的生长时期。一般的，微生物的生长时期分为迟滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期。处于对数生长期的微生物量很大且具有较高的细胞活性，适宜作为生物识别元件。李洛娜等人［5］选择对数生长末期的枯草芽孢杆菌进行固定，制成微生物膜，进行BOD 检测。该传感器的响应时间仅为8 min。

1.2 微生物固定化

微生物固定具有热稳性较高，可重复使用和反应后无需与反应物分离等优点，且有研究发现，固定微生物制备的传感器具有更宽的线性范围［15］，故一般传感器制备过程中需要固定微生物。固定材料和方法影响着传感器的灵敏度、响应时间和使用寿命等。目前，微生物固定方法主要有吸附法、包埋法、夹层法和交联法等。

吸附法是利用载体之间的静电相互作用进行细胞固定，可分为物理吸附和离子吸附。吸附法操作简单，对微生物无毒害作用，细胞活性损失小，但长时间使用后菌种易脱落，影响使用寿命。Dhall P 等人［16］运用吸附法将增效的菌群固定在尼龙膜(孔径为0.45 μm)上制成微生物膜，固定于氧电极上构成BOD 传感器。该传感器响应时间为90 min，可以在400 d 内、间断测量条件下保持稳定性和活性。

包埋法是最常用的方法，它是将细胞裹于凝胶的微小格子内或半透膜聚合物的超滤膜内。包埋法制备的微生物膜机械强度虽有提高，微生物活性也较交联法高，但该方法不适用于涉及大分子物质的反应，故在实际检测中需对水样进行预处理。Liu Ling 等人［17］利用共焦激光扫描显微镜(CLSM)技术研究固定在有机无机复合材料上菌种的变形，进而研究其长期稳定性机理。研究结果表明，T.cutaneum 2.570 细胞包埋于硅和PVA－g－P(4－VP)的混合物中，其储存时以节分生孢子状态存在，这些休眠状态的细胞能抵抗环境压力，并能在适当的条件下被激活。Wang Jianlong 等人［18］将活性污泥包埋于聚乙烯醇(PVA)中形成珠状颗粒置于特制的笼子中，笼子连接到小型升降机上，制成反应器式BOD 传感器。该固定方法使得溶解氧和有机物的传质阻力明显降低，有效提高了BOD 检测的灵敏度，并能够保持生物活性70 d(每天测量8 次)。

夹膜法制备的微生物膜，使用寿命延长，菌体不易流失，操作简单，无需任何化学处理，重现性较好，尤其适用于微生物和组织膜的制作，但其所需活化时间较长，制备中存在菌种定量问题。

交联法是化学固定方法，采用非水溶性载体，如戊二醛、偶联苯胺和牛血清白蛋白等。Yang Zhen 等人［4］将含有T.cutaneum 的混合溶液(含光致交联的聚酰亚胺)浇铸在氧电极阴极，然后在N2环境中紫外曝光3 min，制备好的BOD 传感器置于磷酸缓冲液中。该法制备的微生物膜使用寿命提高，但固定微生物的成活率较低，制备过程较复杂，交联剂用量和微生物量相互制约。

此外，微生物也可通过制备一定的反应器结构进行固定。Liu Changyu 等人［19］用HF/NH4F 溶液冲洗螺旋玻璃管内壁得到粗糙内表面。在优化的流速和温度下向管内通入活性污泥培养液，通过溶解氧探针测量注射校准溶液后的电流响应来检验生物膜形成情况，当电流下降到一个稳定值时，稳定的生物膜形成。

1.3 换能器

BOD 微生物传感器根据其换能器的不同可大致分为电化学型和光学型。电化学型BOD 传感器又可分为氧电极型、媒介体型和微生物燃料电池型等。

1.3.1 氧电极型

氧电极型BOD 微生物传感器最为普遍，是在电极表面覆盖氧渗透膜和微生物膜，通过测量添加样品前后溶液中溶解氧浓度变化检测BOD。研究人员在工作电极选择、电极表面修饰以及氧渗透膜的制备等方面都进行了广泛的研究。

Ivandini T A 等人［20］研制了一种具有高稳定性的修饰金纳米颗粒的掺硼金刚石电极，用于测定水中溶解氧，进而测定BOD。金纳米颗粒催化O2的还原反应，其与掺硼金刚石之间的共价键提高了表面修饰的稳定性，从而提高了传感器的稳定性，其电流响应的相对标准偏差仅为0.9%。Pang Heileung 等人［21］将TMOS，DiMe－DMOS，0.1 mol/L HCl和去离子水以1∶2.15∶1.7∶1.1 的体积比混合制备硅溶胶。该硅溶胶在25 ℃水浴中搅拌3.5 h 后以7 500 rpm 离心4 min。收集离心管底部的凝胶部分(1 mL)并将其与［Ru(dpp)3］Cl2(250 μL)溶液混合。32 μL 混合液置于每个微滴定板孔内，室温暗处保存6 d 以制备一种高吞吐量的氧敏感膜。该膜中心厚度小于10 μm，均一无裂缝，具有很好的稳定性，可与聚苯乙烯微滴定板紧密黏附，且由于其疏水性可防止溶于水的离子或化合物的干扰，进而实现样品中溶解氧的测定。

1.3.2 媒介体型

媒介体型BOD 微生物传感器是以可逆氧化还原物，如铁氰化钾、二茂洛铁等，替代溶解氧促进有机物发生生化反应，实现电子转移，通过测量电极表面媒介体发生氧化反应的电子转移数实现BOD 的检测。该方法有两个显著优点:媒介体具有极强的氧化还原性能，可提高反应速率，减少反应时间;媒介体具有很高的溶解性，使输出信号较大，检测范围较宽，有效克服了由于O2在水中的低溶解度带来的响应信号弱和样品需大量稀释的问题。

Bonetto M C 等人［22］研究发现，选用K.pneumoniae 并利用铁氰化物进行BOD 快速检测时，样品中的溶解氧对测定结果无影响，故无需对样品进行除氧预处理，用GGA 溶液和OECD 溶液标定时其线性范围分别为30 ～500mg/L 和30 ～200mg/L。Oota S 等人［23］将铁氰化物溶于磷酸载体溶液，制备流动注射微生物反应器式BOD 传感器。由于每次仅注射少量样品溶液，系统的操作稳定性较高。媒介体不仅可以溶于载体溶液，也可以被固定成膜参与反应。Liu Ling 等人［24］将E.coli 和中性红(neutral red，NR)媒介体混合固定成膜置于玻碳电极上，由于中性红的强电子传输特性和膜的渗透性，制备的传感器较分别固定两层膜具有更强的响应信号。对于某些微生物，仅使用一种媒介体不能进行测试，需要采用双媒介体系统。Nakamura H 等人［8］研究发现，真核生物S.cerevisiae 只有在铁氰化物和甲萘醌共同存在时才能进行响应。分析认为甲萘醌可以渗入菌种外壁，产生甲萘醌基团，与铁氰化物共同作用实现电子传递。

1.3.3 微生物燃料电池型

微生物燃料电池型BOD 传感器是以微生物为催化剂，将有机物中的化学能转换为电能的装置［25］。电池转化率一定，其产生的电荷量与底物质量浓度呈正比。典型微生物燃料电池由阳极室和阴极室构成，2 个极室由质子交换膜隔开，阳极室保持厌氧环境而阴极室保持好氧环境，阴阳两极通过外电路连接。阳极室中，微生物催化分解有机物并释放电子和质子，电子传递至阳极，后经外电路传递至阴极，质子经质子交换膜传递至阴极，并与来自外电路的电子和阳极室的O2反应生成水。微生物燃料电池型BOD 传感器响应时间短，适用范围广，稳定性好且操作简单，但质子交换膜的成本较高。吴锋等人［26］研制了一种单室微生物燃料电池型BOD 传感器。以MnO2代替金属铂作阴极催化剂，以阳离子交换膜代替昂贵的质子交换膜，对实际水样进行检测。传感器线性范围为5 ～50 mg/L，与BOD5的相对误差在4.0%以内。

1.3.4 光学型

光学型BOD 传感器是利用光源发出的光经过不同浓度样品时，会引起光强、频率、相位、偏振态等光学参数的变化，通过检测这些参数的变化获得待测样品信息。光学型BOD 传感器具有实时、快速、响应不受样品流速影响等特点，但传感器灵敏度、稳定性和使用寿命等方面还不能满足现场监测的需求。

Sakaguchi T 等人［6］将从Vibrio fischeri 中提取的发光基因(lux A－E)植入E.coli，制成BOD 荧光传感器。样品中有机物含量不同时，微生物的发光强度不同，其检测范围为(3～200)×10－6。除利用微生物自身发光，也可通过加入发光物质进行检测。Nakamura H 等人［7］利用S.cerevisiae与甲萘醌和溶解的有机物之间的还原反应产生过氧化氢和过氧根离子，这些产物在铁氰化物的催化作用下与发光氨反应并产生430 nm 的化学发光，发光强度随有机物浓度的增加而增强，实验上证明了该方法用于BOD 检测的可行性。Nakamura H 等人也实验了一种通过测定吸光值检测BOD 的方法［27］，即选择2，6－二氯酚吲哚酚钠(DCIP)作为还原颜色指示剂，微生物降解有机物，通过检测DCIP 吸光值的减少量即可得到BOD 值。Zheng Ruijuan 等人［28］用CdS 修饰碳电极，加阴极脉冲电压使电极表面发生热电子引发的阴极电化学发光，光强随样品中溶解氧浓度的增大而增强，检测线性范围为1.7 ～33 mg/L，9 次平行检测(8 mg/L溶解氧)的相对标准偏差为1.56%。该方法用于BOD 中溶解氧检测，价格便宜，易于制造，稳定性和重复性较好。

1.3.5 其它类型传感器

Zhang Jinzhong 等人［29］研制了一种通过测定压电系统频率改变量检测BOD 的传感器。微生物将有机物分解为无机或有机小分子，使样品电导率发生变化，电极输出连接晶振，测晶振的频率改变量以测定BOD。该方法无需固定细菌，操作简单方便。

2 BOD 微生物传感系统

BOD 微生物传感系统需要完成从采样到得到准确BOD 结果的全过程。除研究构成传感器的关键技术外，也需要进行预处理水样，选取标准溶液，优化测试条件和选择测定方法等环节。

2.1 水样预处理

采集到的水样一般不能直接进行检测，若样品BOD 超出检测范围，需进行稀释。Dhall P 等人［16］利用软件快速计算样品稀释倍数，构建的BOD 检测系统可以用于高BOD的饮料工业废水的检测，若样品中含有大量重金属离子，会影响微生物活性。Qian Zhengrong 等人［16］研究发现通过加入有机螯合剂EDTA 或DDTC 等可使重金属离子形成金属络合物，从而减轻重金属离子对检测的影响。由于BOD 微生物传感器的反应时间较短，若样品中含有难生物降解的有机物将严重影响检测，可以先将难以快速生物降解的有机物催化分解，再进行微生物降解。Chee Gab Joo 等人［30］利用臭氧分解产生的自由基分解样品中难以生物降解的有机物，然后用BOD 传感器进行检测。臭氧预处理后1 mg/L BOD 溶液的响应强度可达处理前的1.6 倍，传感器检测下限为0.5 mg/L，响应时间缩短至5 min，标准偏差明显减小。该研究组还探索了一种光催化预处理方法［32］。利用TiO2作光催化剂，仅曝光4 min 即可对样品进行降解预处理。此外，利用电化学氧化过程［33］、超声和加热处理［34］等人也可对有机物进行降解预处理。

2.2 标准溶液的选取

对BOD 传感器进行标定时，国标采用的标准溶液是GGA 溶液，即150 mg/L 谷氨酸和150 mg/L 葡萄糖溶液的混合液，其BOD 值为(198±31)mg/L。很多BOD 传感器的标定以GGA 溶液作为标准溶液［3，4，16，17］。但是GGA 溶液用作标准溶液存在一些缺陷:GGA 溶液仅含2 种有机物，葡萄糖是大多数微生物的碳源，而谷氨酸一般需要较长时间才能被分解。因此，一些BOD 微生物传感器选择OECD溶液(organization for economic cooperation and development solution)作为标准溶液进行标定［35］。此外，AWW(artificial wastewater)也可用作标准溶液。Liu Changyu 等人［19］利用AWW 作为标准溶液，自来水作为空白溶液进行标定，避免了磷酸缓冲液引入的二次污染，可实现太湖水样BOD 的快速检测。标准溶液的选取与检测方法和废水的类型有关，选取适当的标准溶液可以提高传感器检测的准确度。

2.3 测定条件的优化

测定过程中，微生物受环境影响很大。pH 可以改变细胞膜的带电荷状态，影响细胞对营养物质的吸收和代谢过程中酶的活性。温度影响微生物中酶和蛋白质的合成和活性。不同微生物生长代谢所需pH 和温度不同，所以，需要针对所选微生物进行调节［6，9］。此外，测试过程中的缓冲溶液浓度、微生物培养时间、传感器响应时间以及流动注射系统中溶液流速等都需要进行优化。

2.4 测定方法的选择

BOD 检测方法可分为稳态法和起始速率法。稳态法是测定样品反应前后输出的2 个稳定值，求差值ΔI 进行计算，输出信号与微生物的数量、生存能力和呼吸速率有关。该方法具有良好的稳定性和重复性，检测下限低，但检测时间和恢复时间都较长。起始速率法是检测加入样品后输出信号的变化率(dI/dt)，输出信号受有机物和氧气的传质速率影响。该方法检测灵敏度高，线性范围宽，响应时间和恢复时间均较短，但易受整个测试系统不稳定因素的影响，稳定性不如稳态法［36］。

2.5 提高信号强度

一般的，BOD 传感器固定的微生物量有限，水中O2溶解度较低，导致输出信号微弱不易检测。如1.3.3 中提到的，可以使用媒介体参与反应，以消除因水中O2溶解度小引起的信号强度限制。从菌种角度出发，可选用广谱性好的菌种。从样品角度出发，可进行预处理将难降解有机物分解，便于微生物的代谢。此外，有研究发现，菌种处于“饥饿”状态会表现出更强的外源代谢能力。Yoshida N 等人［35］选择在使用前处于有氧、无营养物质的溶液(0.1 mol/L NaCl 溶液)中培养的微生物制备传感器，输出信号提高约7 倍，避免了使用前复杂的预处理过程。

3 有待研究和解决的问题

1)由于BOD5和BOD 微生物传感器的检测机理不完全一致，BOD5可以检测到难降解和易降解的有机物，而BOD 微生物传感器由于检测时间短只能检测易降解有机物。尽管2 个变量线性相关显著，但它们之间的内在联系还有待充分的研究和验证，需要对检测机理做进一步深入的研究。

2)传感器通用性有待提高。不同水体的BOD 含量相差甚远，主要有机污染物不同，干扰物质也不同。因此，目前针对不同类型的废水设计出了特定的BOD 传感器［16，23］。研究人员正在探索通用型BOD 传感器。Raud Merlin 等人［37］将固定有不同微生物的BOD 传感器组成阵列，利用所选微生物对特定物质的降解性，运用PLS(partial least squares)回归方法处理数据，实现对含有不同难降解有机物OECD 废水的BOD 测定。若要使BOD 检测走向规范化和标准化，研究人员仍需进一步探索归一化、通用化的检测原理和方案。

3)传感器检测稳定性和一致性有待提高。目前，BOD微生物传感器虽有部分进行了商业化，但大部分仍处于实验室研究阶段。微生物的稳定性、微生物固定的一致性和微生物膜活性减弱导致的更换等都将影响BOD 微生物传感器的性能，故其要投入应用，还需提高其稳定性和一致性。

4)微生物传感器的微型化、集成化程度不够，难以进行实时在线监测。目前商业化的BOD 微生物传感器的体积和质量均偏大，不能完全达到便携式的要求。Yang Zhen等人通过引入对照组电极(不固定微生物)，仅测量实验组和对照组电极参数之间的差值即可实现BOD 测定，省去了搅拌子和充气泵等设备。研究人员也在探索将微电极、微加工技术等应用于微生物传感器以实现整个传感器系统的微型化和便携化。

4 结束语

BOD 检测对于水质和一些生化过程的监测具有重要意义。由于传统BOD5存在耗时长，重现性差，易受干扰等问题，BOD 的快速测定成为发展方向。今后须结合生物技术与信号处理技术，在保证生物活性的基础上，提高固定的稳定性与一致性，实现对各类废水的统一检测。另外，应进一步结合微生物检测与微加工技术，促进传感器的微型化与集成化。

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