响应面法优化芦荟皮多糖的微波辅助提取工艺及抗氧化活性研究

马艳弘，刘　晨，张宏志，李亚辉，黄开红

(1.江苏省农业科学研究院农产品加工研究所，江苏南京210014；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457)

响应面法优化芦荟皮多糖的微波辅助提取工艺及抗氧化活性研究

马艳弘1，刘晨2，张宏志1，李亚辉1，黄开红1

(1.江苏省农业科学研究院农产品加工研究所，江苏南京210014；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457)

摘要：研究芦荟皮多糖的微波辅助提取工艺及其抗氧化能力。在单因素试验基础上，以微波时间、微波功率、料液比、水提温度为因素，采用Box-Benhnke试验设计，以多糖得率为响应值，进行响应面分析，并考察芦荟皮多糖的抗氧化活性。结果显示，芦荟皮多糖的最佳微波辅助提取条件为料液比1∶31(g/mL)、微波时间95 s、微波功率400 W、提取温度74 ℃，在此条件下芦荟皮多糖提取率为4.926%；所提芦荟皮多糖能够降低脂质过氧化物形成、清除DPPH自由基和羟自由基，具有较强的抗氧化能力，且在一定浓度范围内，其抗氧化能力与粗提物浓度呈现一定的剂量效应关系。

关键词：芦荟皮；多糖；微波辅助提取；响应面分析；抗氧化活性

芦荟为芦荟属百合科多年生常绿多肉质草本植物[1]，具有极高的经济价值和开发前景。研究发现，芦荟含有160多种化学成分，72种成分具有生物活性。包括芦荟多糖、有机酸、黄酮、芦荟大黄素、大黄酸、芦荟苷等[2]。其中芦荟多糖(aloe polysaccharide)是芦荟最主要的生理活性成分之一，具有抗氧化、抗癌、抗菌消炎、保护心血管、降血糖、增强机体免疫力、延缓衰老等多种药理保健功能[3-8]。素有“天然美容师”、“家庭医生”等美誉，被联合国粮农组织列为“21世纪人类的最佳保健品之一”，是国内外公认的药食同源性植物。

随着人们对芦荟药用价值的认识，芦荟在保健品、美容护肤、药物中间体制备等方面得到了广泛应用。目前市场上的芦荟产品均以芦荟去皮后的叶肉为原料加工而成，95%以上的芦荟皮被丢弃而未得到充分利用，不仅造成了资源的极度浪费，还容易引起严重的环境污染。研究报道芦荟多糖不仅存在于芦荟凝胶中，芦荟叶表皮角质下的栅栏组织中也贮存着大量的多糖[9]。但迄今为止有关芦荟皮中活性多糖的高效提取技术仍未见报道。

近年来微波提取技术因其操作简便、产率高及产物易提纯等优点在天然产物提取中得到了广泛应用[10-12]。因此，本研究以库拉索芦荟(aloe vera)的加工废弃物芦荟皮为研究材料，通过Box-Behnken试验设计及响应面分析(response surface methodology，RSM)优化芦荟皮中芦荟多糖的提取工艺，并探讨其抗氧化活性，为提高库拉索芦荟加工附加值、降低生产成本、保护生态环境、提高资源的综合利用率提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

库拉索芦荟皮,由徐州华瑞芦荟制品有限公司提供；无水乙醇、浓硫酸、柠檬酸、硫氰酸氨、氯化亚铁，南京化学股份有限公司生产；抗坏血酸、葡萄糖、苯酚,西陇化工股份有限公司生产,上海源叶生物科技有限公司生产；PBS磷酸缓冲液,北京奥莱宝生物有限公司生产；亚油酸、DPPH，美国Sigma公司生产。以上试剂均为分析纯。羟自由基测定试剂盒，南京建成生物工程研究所生产。

1.2仪器设备

Epoch微孔板分光光度计，美国Biotek公司；格兰仕G80W23YSL-V3型微波炉，格兰仕微波炉电器有限公司生产；RE-5220型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器生产；JJ500型电子天平，常州双杰测试仪器厂生产；HJ-6A多头磁力加热搅拌器，常州国华电器有限公司生产。

1.3实验方法

1.3.1芦荟多糖提取工艺芦荟皮清洗干净后，50 ℃烘干至恒重，粉碎，过60目筛，称取5 g样品粉末，按照一定的固液比与蒸馏水混合，置于微波炉于不同微波功率和不同微波时间进行微波辅助提取，将微波辅助提取后的提取液置于不同温度下提取2 h，过滤，滤渣再提取1次，合并2次滤液，减压旋蒸浓缩后，用4倍体积的80%乙醇(V/V)沉淀静置过夜，3 500 r/min离心15 min，无水乙醇洗涤即可得芦荟皮多糖粗提物。再于通风橱中室温干燥，放入干燥器内贮藏备用。

1.3.2多糖提取率的测定以葡萄糖作为标准，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，再根据如下公式计算提取率。

多糖得率=0.9×多糖质量浓度×多糖提取液体系×100%/原料质量

(1)

式中：0.9 为葡萄糖的换算系数。

1.3.3单因素试验设计以多糖提取量为目标，按照上述多糖提取工艺，分别考察不同微波时间、不同微波功率、不同液料比和不同提取温度对芦荟皮多糖提取率的影响。

表1　芦荟皮多糖提取的单因素实验设计

1.3.4Box-Behnken试验设计及响应面分析在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken 设计方案，以微波时间A、微波功率B、料液比C、提取温度D为考察因素，以多糖提取率为响应值，利用Design-Expert8.05b软件优化芦荟皮多糖提取工艺。 试验因素、水平编码见表2。

表2　Box-Behnken试验设计因素和水平编码表

(2)亚油酸体系法测定抗氧化能力。参考Braca等的检测方法[14]。将多糖粗提物配制成浓度为5、10、15、20、25、30 mg/mL的水溶液，各取2 mL分别置于10 mL的具塞试管中，加入体积分数为2.51%的亚油酸无水乙醇溶液2 mL、0.05 mol/L pH7.0的PBS磷酸盐缓冲液4 mL、蒸馏水2 mL，涡旋振荡混匀，密闭后置于40℃恒温水浴锅中避光水浴。空白不加抗氧化剂，其余处理相同。取0.1 mL以上混合溶液，加入体积分数为75%的乙醇9.7 mL和30%的硫氰酸铵0.1 mL、以及0.02 mol/L 氯化亚铁(3.5%盐酸配制) 溶液0.1 mL，混匀。准确反应5 min后，500 nm处测定吸光度。每隔12 h测定1次。共测定96 h。以上试验平行进行3次，结果取平均值。

(3)羟自由基清除能力测定。采用羟自由基测定试剂盒进行测定，将芦荟皮多糖粗提物制成浓度为5、10、15、20、25、30 mg/mL的水溶液，按照试剂盒说明书进行操作。空白组以蒸馏水代替，标准组以0.03% H2O2代替，对照组以同浓度抗坏血酸代替。反应后，550 nm处测吸光度值。以上试验均重复3次，结果取平均值。

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1微波时间对多糖提取率的影响考察不同微波处理时间对芦荟皮多糖提取率的影响。由图1可知，随着微波时间的延长，芦荟皮多糖提取率增大，当微波时间为90 s时，提取率达最大，超过90 s后，微波提取率略微下降。原因可能为微波时间越长，多糖类化合物溶出的越多，测定值越大。当提取时间达90 s 以后，由于温度升高而导致部分多糖分解致使多糖提取率略微下降。因而确定最适微波时间为90 s。

图1　微波时间对芦荟皮多糖提取率的影响Fig.1　Effect of micro-wave time on polysaccharides extraction rate

图2　微波功率对芦荟皮多糖提取率的影响Fig.2　Effect of micro-wave power on polysaccharides extraction rate

2.1.2微波功率对多糖提取率的影响考察不同微波功率对芦荟皮多糖的影响，由图2可知，随着微波功率的增加，芦荟皮多糖的提取率增大，当微波功率达400 W时，提取率达到最大，继续提高微波功率，多糖提取率则不增反降。这可能是因为微波功率过大造成提取液温度过高，使部分多糖分解造成提取率小幅降低。

2.1.3液料比对多糖提取率的影响考察不同料液比对芦荟皮多糖的影响，由图3可知，随着料液比的增加，多糖提取率逐渐增大，但是当料液比达1∶30后，多糖溶出量增幅很小，趋于稳定。这是因为料液比达到一定比值时，芦荟皮中多糖基本全部溶出，扩散达到平衡[15]，继续增大溶剂剂量也不会促进多糖的提取，反而会加重后续浓缩负担。因此，提取芦荟皮多糖适宜的料液比为1∶30。

图3　液料比对芦荟皮多糖提取率的影响Fig.3　Effect of liquid-solid rate on polysaccharides extraction rate

图4　提取温度对芦荟皮多糖提取率的影响Fig.4　Effect of extract temperature on polysaccharides extraction rate

2.1.4提取温度对多糖提取率的影响考察不同提取温度对多糖提取率的影响。由图4可知，低于70 ℃时，提取率随提取温度的提高而上升，当温度达70 ℃时，提取率达最大。温度超过70 ℃后，多糖提取率又随温度升高而下降。这是因为随着提取温度升高，多糖降解率也增大，从而导致了提取率下降[16-17]。因此考虑70 ℃为芦荟多糖适宜的提取温度。

2.2芦荟皮多糖提取响应面优化分析

2.2.1试验结果与模型建立在单因素试验基础上，采用Box-behnken 设计方案，以多糖提取率为响应值，优化芦荟皮多糖提取工艺。试验结果见表3(实测值为3次平行试验结果平均值)。

应用Design Expert软件对27个试验的响应值进行多元回归分析，得到以芦荟皮多糖提取率为响应值的回归方程为：Y=-2.38+0.027A+4.025×10-3B+0.19C+0.061D+3.33×10-6AB-3.33×10-4AC+5.00×10-5AD+5.00×10-6BC-2.25×10-5BD-5.50×10-4CD-1.17×10-4A2-3.50×10-6B2-1.90×10-4C2-2.63×10-4D2。

2.2.2方差分析与显著性检验对模型方程进行显著性检验，由表4方差分析结果可见，回归模型极显著(P<0.000 1)，失拟项(P=0.413 7)不显著，实际试验值与预测值具有高度相关性(R2=0.926 9)，表明模型与试验值拟合良好[18]，试验方法可信度高，该模型可以对芦荟皮多糖的提取率进行准确的预测和分析。由表4还可知，四个自变量对响应值的影响程度大小依次为液料比(C)>提取温度(D)>微波时间(A)>微波功率(B)，其中因素A、C、D以及4个因素的二次项对芦荟皮多糖提取量影响极显著(P<0.01)，AC、BD、CD的交互作用对响应值的影响显著(P<0.05)。

表3　响应面实验设计及结果

2.2.3响应面分析与优化图5至图7反映了几个因素间交互作用对多糖提取率的影响情况。响应曲面图中曲面的陡峭程度可以表明变量对多糖提取率的影响程度，曲面较陡表明影响较大，反之则较小；而等高线图反映了因素间交互作用的强弱大小，椭圆形表示交互作用显著，圆形表示交互作用不显著[19]。由图5～7可知，任何两个交互因素的响应面都存在最高点，微波时间和料液比的交互作用、微波功率和提取温度的交互作用、以及料液比和提取温度的交互作用对提取率的影响极显著(等高线图为椭圆形)。同一料液比水平下，随提取温度和微波时间的增加，多糖提取率先逐渐提高后趋于平缓；同一提取温度条件下，随微波功率和料液比的增加，多糖提取率先逐渐增加后趋于平缓。

表4　方差分析

**表示差异1%水平显著性，*表示差异5%水平显著性。** significant at 0.01 level，* significant at 0.05 leve1.

通过软件分析得到提取芦荟皮多糖的最优提取条件为：微波时间94.42 s、微波功率402.05 W、料液比1∶31.13、提取温度74.71 ℃，多糖的预测得率为4.928%。为了操作方便，修正最佳提取条件为微波时间95 s、微波功率400 W、液料比1∶31(g/mL)、提取温度74 ℃。在此条件下进行3次平行验证试验，测得芦荟皮多糖提取率为4.926%，与理论预测值4.928%基本一致。表明所得模型可以较好的预测芦荟皮多糖的提取情况。

图 5　微波时间和料液比对多糖提取率的交互作用Fig.5　Correlative effects of micro-wave time and solid-liquid rate on polysaccharides extraction rate

2.3芦荟皮多糖抗氧化活性分析

2.3.1DPPH自由基清除能力分析检测所提芦荟皮多糖对DPPH自由基的清除能力，由图8可知，在所设浓度范围内，DPPH自由基清除率随芦荟多糖浓度增加逐渐增强，当浓度达到30 mg/mL时，DPPH自由基清除率达70.32%。略低于同浓度抗坏血酸的DPPH自由基清除率。

图6　微波功率和提取温度对多糖提取率的交互作用Fig.6　Correlative effects of micro-wave pover and extract temperature on polysaccharides extraction rate

图7　液料比和提取温度对多糖提取率的交互作用Fig.7　Correlative effects of solid-liquid rate and and extract temperature on polysaccharides extraction rate

图8　芦荟皮多糖DPPH自由基清除能力Fig.8　DPPH radical scavenging capacities of aloe peels polysaccharide

2.3.2亚油酸体系法测定抗氧化能力分析采用亚油酸体系法检测所提芦荟皮多糖对脂质过氧化物的抑制能力。吸光度越小，表明其对生成的脂质过氧化物的抑制能力越强。由图9可知，在96 h内空白组吸光值快速增大，表明有大量的过氧化物形成；不同浓度芦荟皮多糖溶液吸光值均低于空白组，同一测定时间下，吸光值随着芦荟皮多糖浓度的增高而逐渐降低。表明检测体系内脂质过氧化物浓度随着时间延长而提高，芦荟皮多糖对脂质过氧化的生成具有明显的抑制作用，且浓度越高，其抑制作用越强。

图9　芦荟皮多糖对脂质过氧化物的抑制作用(亚油酸体系法)Fig.9　Inhibitions effect on aloe peels polysaccharide to lipid peroxidation by linoleic acid method

图10　芦荟皮多糖羟自由基清除能力Fig.10　Hydroxyl radical scavenging capacities of aloe peels polysaccharide

2.3.3羟自由基清除能力分析考察所提芦荟皮多糖对羟自由基的清除能力，由图10可知，随着芦荟皮多糖溶液浓度的增加，羟自由基清除率也逐渐增大。在0～5 mg/mL内，相同浓度的芦荟皮多糖与抗坏血酸的羟自由基清除率相差不大；在5～30 mg/mL内，芦荟皮多糖对羟自由基的清除率则大于相同浓度抗坏血酸的羟自由基清除率。当两者浓度均为30 mg/mL时，芦荟皮多糖的羟自由基清除率和抗坏血酸的羟自由基清除率分别为70.9%和62.4%，与抗坏血酸相比，芦荟皮多糖的羟自由基清除率提高了13.62%。

由以上试验结果表明，芦荟皮多糖具有较强的抗氧化活性。但其结构与功能的构效关系尚不明确，因此对芦荟皮多糖的分离纯化、结构鉴定、构效关系等相关研究仍需深入开展。目前，相关试验正在进行中。

3结论

在单因素试验基础上，通过响应面法对微波辅助提取芦荟皮多糖工艺进行优化，建立了可靠的预测模型，得到芦荟皮多糖的最佳提取工艺条件，即微波辅助时间95 s、微波功率400 W、料液比1∶31(g/mL)、提取温度74℃。在此条件下芦荟皮多糖提取率为4.926%，与理论预测值4.928%基本一致，模型方程高度显著，拟合度良好，可以较好的预测芦荟皮多糖的提取得率。对所得芦荟皮多糖粗提物进行抗氧化活性研究，结果显示芦荟皮多糖对DPPH自由基、羟自由基的清除率以及对脂质过氧化物生成的抑制率随浓度增大而增强。当芦荟皮多糖粗提物浓度达30 mg/mL时，与同浓度抗坏血酸的抗氧化能力相比，其羟自由基清除能力提高了13.62%。可见，微波辅助提取的芦荟皮多糖得率较高、抗氧化能力较强，既对节能环保、提高芦荟皮资源的利用率提供了很好的思路，也可为芦荟皮多糖的工业化生产提供理论依据。

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Response Surface Methodology for Optimization of Microwave-assisted

Extraction of Polysaccharides from Aloe Peel and

Evaluation of Their Antioxidant Activity

MA Yan-hong1,LIU Chen2,ZHANG Hong-zhi1,LI Ya-hui1,HUANG Kai-hong1

(1.Institute of Agricultural Products Processing,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China;2.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

Abstract：Response surface methodology(RSM) was used to optimize the conditions for microwave-assisted extraction of polysaccharides from aloe peel,and the antioxidant activity of polysaccharides was also evaluated.Based on single-factor tests,Box-benhnken center composite experiment was carried out with four factors，including microwave time,microwave power,solid-liquid rate and extraction temperature.RSM was used to determine the efect of prime factors on the yield of polysaccharides.Besides,the antioxidaut activity of the polysaccharides was evaluated in vitro.The results showed that the optimal parameiers of microwave-assisted extraction were solid-liquid ratio 1∶31,microwave time 95 s,microwave power 400 W,extraction temperature 74 ℃.Under the optimal conditions,the polysaccharide extraction rate was 4.926%.The antioxidant activity of the polysaccharides from aloe peels was found in a dose dependent manner.

Key words:aloe peels;polysachharides;microwave-assisted extraction;response surface methodology;antioxidant activity

作者简介：马艳弘(1972—)，女，副研究员，博士，主要从事发酵食品与农副产品资源综合利用研究，E-mail:mayhhyy@126.com。

基金项目：江苏省农业科技自主创新基金产业技术体系类项目[CX(12)1005]

收稿日期：2014-08-12修回日期：2014-10-23

中图分类号：TS201.1

文献标志码：A

文章编号：1000-2286(2015)01-0149-08