胃癌组织Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、血管内皮生长因子表达情况和微血管密度变化及其临床意义

李菊霞，吴士茜，袁艳龙，孙 颖，张丽华，田云霄

·论著·

胃癌组织Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、血管内皮生长因子表达情况和微血管密度变化及其临床意义

李菊霞，吴士茜，袁艳龙，孙 颖，张丽华，田云霄

目的 观察胃癌组织Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)表达情况及和微血管密度(MVD)变化，探讨其临床意义。方法 选取2010—2013年在邯郸市中心医院行胃癌切除术患者56例，收集其胃癌组织标本56份和残端正常胃黏膜组织标本40份。采用EliVisionTM免疫组织化学法检测Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF表达情况和MVD(CD34标记)。结果 正常胃黏膜组织Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF阳性表达率分别为27.5%、35.0%、12.5%，低于胃癌组织中的76.8%、83.9%、89.3%(P<0.05)。不同性别、年龄、肿瘤大小患者胃癌组织Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；不同肿瘤分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移患者胃癌组织Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF阳性表达率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF阳性表达者MVD高于阴性表达者(P<0.05)。胃癌组织中Bmi-1蛋白表达与MMP-9蛋白表达(r=0.450)、VEGF表达(r=0.493)呈正相关(P<0.05)。结论 Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白和VEGF在胃癌组织中均呈高表达，且肿瘤分化程度较低、TNM分期较晚和有淋巴结转移患者胃癌组织Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白和VEGF阳性表达率明显升高，且与MVD密切相关。

胃肿瘤；Bmi-1；MMP-9；血管内皮生长因子A；微血管密度

胃癌是最常见的消化系统癌症，严重危害人们的生命健康。据调查资料显示，我国胃癌病死率在各种恶性肿瘤病死率中排第3位，仅次于肺癌、肝癌[l]。Bmi-1基因是多梳基因(polycomb group genes，PcG)家族成员中的转录抑制因子，是一种公认的原癌基因，其可协同c-myc基因共同作用，促进细胞转化和肿瘤形成[2]。本研究采用微波EliVisionTM免疫组织化学法检测Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白和血管内皮生长因子(VEGF)表达情况和微血管密度(MVD)变化，探讨其与胃癌发生、发展的关系，为揭示胃癌的发生机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究材料 选取2010—2013年在邯郸市中心医院行胃癌切除术患者56例，其中男35例，女21例：年龄40～77岁，中位年龄62.6岁。收集其胃癌组织标本56份和残端正常胃黏膜组织标本40份，由2位高年资病理医师按照WHO标准对全部病理切片进行复核确诊。

1.2 免疫组化检测

1.2.1 主要试剂及仪器 EliVisionTM试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)、二氨基联苯胺(DAB)显色液及Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2.2 方法 采用微波EliVisionTM免疫组织化学法,参照文献[3-4]方法操作，具体操作为石蜡切片脱蜡水化(烤箱56 ℃，30 min)；抗原修复：微波预热5～10 min后自然冷却，3%过氧化氢室温孵育10 min，PBS冲洗3次；加一抗：滴加一抗工作液，4 ℃过夜，PBS冲洗3次；加二抗：滴加二抗工作液室温孵育30 min，PBS冲洗3次，滴加DAB显色液5～20 min，镜下观察，适时终止；苏木素复染；封固。取乳腺癌组织切片作为阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3 判断标准 Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白和VEGF分别表达于细胞核、细胞质和细胞质，以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性表达。参照Parenti等的操作标准，每张切片均随机观察5个高倍视野(×400)，阳性细胞数<5%为(-)，5%～25%为(+)，25%～50%为(++)，>50%为(+++)；(+)～(+++)均视为阳性表达，(-)为阴性表达。MVD(CD34标记)检测:参照Weidner等[5]的评判方法，先在低倍视野(×100)下找到癌组织间质微血管密集部位，再换到高倍视野(×400)下计数5个视野的微血管数，取平均值。

2 结果

2.1 Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF阳性表达情况 正常胃黏膜组织Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF阳性表达率分别为27.5%、35.0%、12.5%，低于胃癌组织的76.8%、83.9%、89.3%，差异均有统计学意义(χ2值分别为23.031、24.113、56.226，P<0.05)。

2.2 胃癌组织Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF表达与患者临床病理特征的关系 不同性别、年龄、肿瘤大小患者胃癌组织Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；不同肿瘤分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移患者胃癌组织Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF阳性表达率比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.3 胃癌组织Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF表达与MVD的关系 Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF阳性表达者MVD高于阴性表达者，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

Table 2 Relationship between the expressions of Bmi-1 protein，MMP-9 protein，VEGF of gastric carcinoma tissues and MVD

项目例数MVDt值P值Bmi-17 654<0 05阳性4350 15±9 36阴性1315 62±5 14MMP-99 671<0 05阳性4758 56±7 84阴性922 63±3 14VEGF 9 014<0 05阳性5048 37±6 38阴性615 64±2 84

表1 胃癌组织Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF表达与患者临床病理特征的关系(例)

2.4 Bmi-1蛋白与MMP-9蛋白、VEGF的相关性 胃癌组织中Bmi-1蛋白表达与MMP-9蛋白表达(r=0.450)、VEGF表达(r=0.493)呈正相关(P<0.05)。

3 讨论

胃癌的发生发展不仅与遗传因素有关，还与环境、幽门螺杆菌(Hp)感染等诸多因素有关。胃黏膜在相关因素作用下受损，如Hp感染、不良饮食习惯或摄入某些致癌物质如亚硝胺、亚硝酸盐类等，黏膜细胞启动细胞凋亡程序以修复损伤，该过程易发展为萎缩性胃炎，如不加以控制则会进展为肠上皮化生-不典型增生-肿瘤形成[6]。多种基因在肿瘤发生发展过程中互相协同、相互作用，进而导致肿瘤恶性转化、转移[7-8]。1991年有学者在癌细胞中发现了Bmi-1基因，该基因是转录抑制因子PcG家族的核心成员之一，其表达水平与肿瘤的发生、发展、侵袭、预后等病理指标密切相关[9]。

3.1 Bmi-1蛋白在胃癌组织中的表达和意义 原癌基因Bmi-1在组织中广泛表达，多在胚胎干细胞、造血干细胞、间质干细胞等较为幼稚的成体细胞中和白血病、恶性肿瘤中呈阳性表达，有研究认为Bmi-1蛋白的高表达是预后差的一个危险因素，如在鼻咽癌[10]、乳腺癌[11]、非小细胞肺癌[12]、结肠癌[13]等均呈高表达，并且高水平表达与肿瘤的恶性程度相关，早期检测Bmi-1蛋白表达水平有助于推断肿瘤恶性程度。推测Bmi-1蛋白在肿瘤发生发展过程中的作用机制可能如下[11]：PcG家族成员Bmi-1可以结合PcG反应元件，使特定靶基因转录沉默；也可以同c-myc等癌基因有效合作激活周期素E，参与细胞周期调控，在细胞增殖、分化、凋亡过程中发挥作用，维持正常干细胞和肿瘤干细胞自我更新，促进肿瘤形成和发展。本研究结果显示，Bmi-1蛋白均可表达于正常胃黏膜组织及肿瘤组织，但Bmi-1蛋白在正常胃黏膜中阳性表达率为27.5%，低于胃癌组织中的76.8%；同时分析了Bmi-1蛋白在胃癌组织中的表达与临床病理特征的关系，结果显示，Bmi-1蛋白的阳性表达与胃癌患者性别、年龄、肿瘤大小均无关；而与肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关，即Bmi-1蛋白的阳性表达可以反映肿瘤分化程度和TNM分期；在有淋巴结转移的胃癌组织中Bmi-1蛋白阳性表达率明显高于无淋巴转移胃癌组织，提示Bmi-1蛋白在胃癌侵袭及转移过程中发挥重要作用。因此可认为Bmi-1蛋白在胃癌组织中的过表达能够作为胃癌诊断及预后判断的有效指标之一，也可以作为胃癌治疗潜在的新靶点，为研制新的胃癌针对性药物提供方向。

3.2 MMP-9蛋白在胃癌组织中的表达和意义 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)主要作用是降解绝大部分细胞外基质(ECM)成分，突破基底膜组织屏障，为恶性肿瘤的侵袭转移提供条件[14]。目前已发现其成员28个，构成MMPs家族。MMP-9是MMPs家族中分子量最大的一种酶，由中性粒细胞、巨噬细胞、毛细血管内皮细胞等间质细胞及恶性肿瘤细胞以酶原形式分泌产生，作用为降解ECM中的Ⅳ、Ⅴ型胶原和明胶等主要成分，破坏ECM和基底膜结构，促使肿瘤细胞向周围组织浸润，因此被认为是肿瘤侵袭转移的新指标[15]。本研究结果显示，MMP-9蛋白在正常胃黏膜组织中呈低表达，在胃癌组织中的表达明显上升，MMP-9蛋白在不同肿瘤分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移患者的胃癌组织中表达阳性率不同，因此推断MMP-9蛋白的异常高表达与胃癌的发生发展相关。

3.3 VEGF在胃癌组织中的表达和意义 VEGF是一种能特异性作用于血管内皮细胞的蛋白因子，VEGF可以增加血管通透性，有助于肿瘤的生长。VEGF具体作用机制如下[16]：(1)直接刺激血管内皮细胞，促使血管生成；(2)促进血浆蛋白原外渗；(3)通过诱导细胞产生蛋白酶以降解ECM，使内皮细胞向外迁移形成新的血管。肿瘤生长、侵袭、转移的前提是血管生成，肿瘤的营养、代谢产物均需要新生成的血管提供，同时还可作为肿瘤细胞的转移路径。VEGF不仅可以促进血管生成，同时还可以诱导淋巴管形成，以此为肿瘤细胞提供养分[17]，因此降解或破坏血管内皮细胞基底膜，增加渗透作用在肿瘤的浸润、转移过程中起关键作用。本研究结果显示，VEGF在正常胃黏膜组织中阳性表达率为12.5%，低于胃癌组织中的89.3%，且在肿瘤低分化和有淋巴结转移的癌组织中阳性表达率高，充分说明在肿瘤的生成、转移过程中扮演着不可替代的角色。

3.4 胃癌组织中MVD的变化分析 肿瘤的转移与新生血管形成关系密切，不管是淋巴转移还是血管转移均需要新生毛细血管参与。有研究证实，胃癌的转移和MVD紧密相关，MVD亦是目前判断胃癌新生血管形成的常用指标[16]。本研究结果显示，Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF阳性表达患者MVD高于阴性表达者，且Bmi-1蛋白表达与MMP-9蛋白表达、VEGF表达呈正相关，表明胃癌组织中MMP-9蛋白破坏肿瘤ECM的同时，Bmi-1蛋白调控VEGF促进肿瘤周围血管生成，三者相互协同，共同作用于肿瘤的侵袭和转移；在肿瘤分化程度较低、TNM分期较晚和有淋巴结转移患者胃癌组织中Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、VEGF阳性表达率明显升高，且与MVD密切相关，检测Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白和VEGF表达情况可以预测胃癌发展及预后。

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(本文编辑：毛亚敏)

Expressions of Bmi-1 Protein，MMP-9 Protein，VEGF and MVD Changes of Gastric Carcinoma Tissues and Their Clinical Significances

LIJu-xia，WUShi-qian，YUANYan-long，etal.DepartmentofOutpatient，HandanMiningGroupLimitedCompanyofJizhongEnergyResources，Handan056000，China

Objective To investigate the expressions of Bmi-1 protein，MMP-9 protein，VEGF and MVD changes of gastric carcinoma tissues and their clinical significances.Methods From 2010 to 2013，a total of 56 patients undergoing gastric cancer resection in the Central Hospital of Handan were selected，56 samples of gastric carcinoma tissues and 40 samples of normal gastric mucosa tissues were collected.EliVisionTMimmunohistochemical method was used to detect the expressions of Bmi-1 protein，MMP-9 protein，VEGF and MVD(CD34signed).Results The positive expression rate of Bmi-1 protein，MMP-9 protein and VEGF of normal gastric mucosa tissues was 27.5%，35.0%，12.5%，respectively，was statistically significantly lower than that of gastric carcinoma tissues of 76.8%，83.9%，89.3%，respectively(P<0.05).No statistically significant differences of positive expression rate of Bmi-1 protein，MMP-9 protein or VEGF of gastric carcinoma tissues was found in patients with different gender，ages，tumor sizes(P>0.05)；while there were statistically significant differences of positive expression rates of Bmi-1 protein，MMP-9 protein and VEGF of gastric carcinoma tissues in patients with different tumor differentiation grades，TNM stages，with or without lymphatic metastasis(P<0.05).MVD of patients with positive expressions of Bmi-1 protein，MMP-9 protein and VEGF of gastric carcinoma tissues were statistically significantly higher than those of patients with negative expressions(P<0.05).The expression of Bmi-1 protein of gastric carcinoma tissues was positively correlated with expression of MMP-9 protein(r=0.450)，expression of VEGF(r=0.493)，respectively.Conclusion Expressions of Bmi-1 protein，MMP-9 protein，VEGF of gastric carcinoma tissues are high，and they are relatively higher in patients with poorly differentiated tumor grades，advanced TNM stages and lymphatic metastasis，and are closely related with MVD.

Stomach neoplasms；Bmi-1；MMP-9；Vascular endothelial growth factor A；Correlation microvessel

河北省卫生厅计划内项目(ZD20140490)

056000河北省邯郸市，冀中能源邯郸矿业集团有限公司机关门诊部(李菊霞)；邯郸市中心医院(吴士茜，袁艳龙，孙颖，张丽华，田云霄)

李菊霞，吴士茜，袁艳龙，等.胃癌组织Bmi-1蛋白、MMP-9蛋白、血管内皮生长因子表达情况和微血管密度变化及其临床意义[J].实用心脑肺血管病杂志，2015，23(6)：38-41.[www.syxnf.net]

R 735.2

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.06.011

2015-03-05；

2015-06-12)

Li JX，Wu SQ，Yuan YL，et al.Expressions of Bmi-1 protein，MMP-9 protein，VEGF and MVD changes of gastric carcinoma tissues and their clinical significances[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(6)：38-41.