利用转基因家蚕丝腺生物反应器生产重组蛋白的应用前景

黄绍华，董久鸣，刘云财，占鹏飞

（1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058；2.浙江省农业技术推广中心，浙江杭州 310020；3.湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313000）

利用转基因家蚕丝腺生物反应器生产重组蛋白的应用前景

黄绍华1，董久鸣2，刘云财1，占鹏飞3

（1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058；2.浙江省农业技术推广中心，浙江杭州 310020；3.湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313000）

家蚕丝腺拥有较强合成丝蛋白的能力，通过利用这一能力，使其能够大量生产有价值的蛋白，人们开始引入转基因家蚕，使它能够在丝腺中合成重组蛋白并分泌到蚕茧中。获得的重组蛋白可在生物学、生物技术，和药学领域中得到广泛应用。我们通过控制合成蛋白在丝腺中的定位，在后部丝腺（PSG）中表达重组蛋白使其定位在不能溶解的丝素中，在中部丝腺（MSG）中表达则定位于亲水外层的丝胶层中。本文主要讨论将转基因家蚕丝腺生物反应器作为优良工具，应用于大量生产药用蛋白和在工业化水平生产相关重组蛋白的可能性，以及生产重组蛋白过程中所面临的挑战和未来的应用前景。

家蚕；转基因家蚕；丝腺生物反应器；重组蛋白

随着社会的发展，生产重组蛋白的需求越来越高。重组蛋白质的生产一直是生物技术产业发展的一大瓶颈，尽管在几乎所有的表达系统都得到了很大的发展，但目前对重组蛋白的大量需求来说，所能提供的重组蛋白产量是远远不够的。

1 转基因家蚕丝腺生物反应器的反应体系

在现行的标准化生产重组蛋白过程中，大肠杆菌表达系统是发展最早、使用最广泛的表达系统，但其翻译后修饰体系不完善，目的蛋白常以包涵体形式表达，产物的生物活性较低，纯化困难；酵母表达系统表达的融合蛋白具有了不完全的糖基化修饰能力；哺乳动物细胞生物反应器主要利用中国仓鼠卵巢细胞（CHO）作为宿主，但培养CHO细胞的生物反应器建立和其运行成本极高。昆虫杆状病毒表达系统是真核表达系统，具有大多数真核生物相似的翻译后修饰及转移外源蛋白的能力，但不能表达完整N聚糖的糖蛋白。利用家蚕多角体病毒（BmNPV）作为载体建立了在家蚕中瞬时表达重组蛋白的系统［1，2］。在这个系统中，重组蛋白的表达仅局限在某一代中，要想表达重组蛋白，每一代必须感染家蚕多角体病毒。考虑到生产重组蛋白的经济性，人们开始将目光投向发展转基因生物作为宿主，包括哺乳动物、鸟、昆虫和植物。

转基因家蚕丝腺生物反应器是利用家蚕丝腺表达重组蛋白的转基因动物表达系统。家蚕经过长达近五千年的人工驯养、选育，已丧失飞翔逃逸能力，是一种非常安全转基因动物，不必担心转基因家蚕飞翔逃逸室外的风险；而在丝蛋白合成、分泌方面具有非常强的能力，在蚕5龄期的短短5～6 d时间里，丝腺体重可增加20多倍，合成丝蛋白质的量占整个蚕体蛋白质总量的70%以上，如此高效的蛋白质合成效率是目前已知其他生物反应器所不具备的；因此，转基因家蚕丝腺生物反应器一旦构建成功，表达外源蛋白效率高，外源蛋白多具有生物活性，蛋白纯化方便，只需要通过饲养转基因家蚕，就可以非常方便地维持表达系统的延续，是一种非常有价值的表达系统。1989年在拟尺蠖中发现了一个叫piggyBac的转座子［3］，利用这个转座子在家蚕中建立了生殖系转基因技术，将插入外源基因的piggyBac的质粒载体和带有piggyBac转座基因的辅助载体，在前胚盘期注射到家蚕卵中［4］，利用标记基因筛选G1代转基因家蚕，确立了比较全面的构建一种转基因家丝腺生物反应器生产重组蛋白的新方法。近年来，家蚕转基因技术有了较大的发展。从选择不同蚕品种，不同蚕卵注射时间，报告基因的选择，转座子载体的选择，转基因家蚕载体中所用启动子的选择，到表达外源基因种类的选择等都获得重大进展［5，6］。

2 丝腺组织与重组蛋白表达

2.1 丝腺组织与丝蛋白合成

丝腺从形态和功能上分为三个不同的区域，后部丝腺（PSG），中部丝腺（MSG），和前部丝腺（ASG）。蚕丝蛋白主要由在后部丝腺合成的丝素和在中部丝腺合成的丝胶两部分组成。丝素蛋白为非溶解性纤维状蛋白，由重链（Fib-H），轻链（Fib-L），和糖蛋白（P25）以6∶6∶1的摩尔比组成；丝素蛋白在PSG中合成，分泌到PSG的内腔中，然后转运到MSG的管腔中；之后丝素蛋白被的亲水性丝胶蛋白包被，并被转运到前部丝腺（ASG），家蚕通过“8”字形的头部运动，将其拉出并在接触空气使之变硬。丝素和丝胶蛋白的质量比分别大约为75%和25%。家蚕丝腺具有高效合成丝蛋白质的能力，借助于丝蛋白启动子的时空特异性，可在家蚕丝腺的特定组织位置大量表达目的蛋白，并利用吐丝结茧收集表达产物，通过转基因技术将家蚕丝腺构建成高效表达外源蛋白质的生物反应器，成为利用家蚕生物反应器表达外源基因的首选。

我们可以通过控制重组蛋白在丝腺组织中的表达区域，间接控制重组蛋白在丝腺中的定位：在PSG中表达基因使重组蛋白定位于丝素，在MSG中表达基因则使重组蛋白定位于外层丝胶层。利用丝腺不同区域的特异性基因启动子，设计并控制重组蛋白在丝腺组织中不同区域表达而达到融合于丝素或丝胶的目的。

2.2 利用后部丝腺表达重组蛋白

利用PSG表达重组蛋白的早期研究主要是以丝素基因Fib-H重链表达系统和Fib-L轻链表达系统在家蚕丝腺细胞中表达GFP基因，GFP蛋白能完整地分泌到丝腺中，说明丝腺细胞能够完整地表达外源蛋白。Tomita等［7］通过构建编码融合蛋白（丝素Fib-L蛋白，人类Ⅲ型胶原蛋白片段）的cDNA，以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作标记，将Fib-L启动子与piggyBac载体重组，利用显微注射法注射到蚕卵中，处理后的转基因家蚕PSG细胞合成重组蛋白，分泌到蚕茧中。融合蛋白C-末端的EGFP区域在分泌的过程中并没有丧失荧光性，因此产生荧光蚕茧，在蚕茧中存在人类胶原蛋白序列也可以通过胶原蛋白酶切实验和氨基酸测序证实。

Hino等［8］将含有Fib-L启动子、人碱性成纤维细胞生长因子基因bFGF的piggyBac质粒导入蚕卵，在家蚕PSG中融合表达了人碱性成纤维细胞生长因子，融合蛋白表达占丝素重量的0.04%。融合到丝素的重组蛋白，能够稳定地插入到不溶解性丝纤维中，在含bFGF的丝素构成的材料上培养细胞能活跃增殖。

利用丝素蛋白Fib-H启动子表达系统，Kurihara等［9］将猫干扰素融合蛋白和携有裂前蛋白酶（Prescission Protease）切割识别位点的丝素蛋白Fib-H重组piggyBac质粒在转基因家蚕丝腺中表达，先用硫氰酸锂溶解丝素，然后用PBS进行透析，再用裂前蛋白酶水解，收集重组猫干扰素，猫干扰素在这一过程中并没有损失其生物活性，并且表现出高度抗病毒活性。Royer等［10］在PSG利用丝素糖蛋白启动子（P25）表达系统表达了红色荧光蛋白（DsRed），通过控制红色荧光蛋白和糖蛋白组成的融合蛋白表达，证明家蚕P25蛋白系统也可以获得完整的表达蛋白。

蜘蛛丝具有巨大的应用前景，而在自然条件下饲养蜘蛛几无可能。利用Fib-H启动子、部分蜘蛛丝纤蛋白编码序列和piggyBac重组载体生产出能够编码蚕丝/蛛丝嵌合蛋白的转基因家蚕。这些转基因家蚕生产出的丝纤维是一种新型复合材料。蚕丝蛋白和蛛丝蛋白以一种极其稳定的方式嵌合到丝纤维中。不仅如此，与亲代丝纤维相比，这些复合纤维的韧性总体上更强，并且与天然蜘蛛丝纤维韧性基本一致。上述结果表明，可利用转基因家蚕生产蚕丝/蛛丝稳定嵌合纤维，从而显著提升亲代家蚕丝纤维的总体机械性质［11］。

人类细胞因子是由免疫细胞和一些非免疫细胞合成和分泌的一群小蛋白，在许多疾病的诊断和治疗中具有广泛的应用。已经在PSG中表达了几种重组人类细胞因子。胰岛素类生长因子（IGF-I），粒细胞-巨噬细胞集落生长因子（GM-CSF）。通过在人类或者小鼠中的生物活性实验证明其生物活性。这些例子表明在家蚕丝腺中生产具有生物活性的重组蛋白是切实可行的。此外，Huan Wang等［15］利用PSG表达系统表达胎盘催乳素（HPL）重组蛋白，通过降低家蚕后部丝腺中内源性蛋白的表达，Fib-H的mRNA水平降低了71.1%，Fib-H在蚕丝蛋白中从91.86%降低到71.01%，而在总丝蛋白中，对应的HPL重组蛋白含量分别达到18.85%和15.46%。结果显示降低家蚕后部丝腺中内源性蛋白的表达可有效提高重组外源蛋白的表达量。

2.3 利用中部丝腺表达重组蛋白

利用中部丝腺表达重组蛋白，分泌到丝胶层中，丝胶层比丝素蛋白亲水性更好，通过这种方法从蚕茧中提取纯化蛋白更有优势。鉴于丝胶蛋白的含量是丝素的三分之一，所以必须在MSG细胞中研究具有高转录活性的调控序列用于基因表达。在MSG表达系统中，用源于BmNPV的增强子hr3和转录激活因子IE1，来增强丝胶Ser1启动子的活性；通过利用hr3和IE1可使Ser1启动子活性增强30多倍。利用这一表达系统，将一段信号肽序列加入到EGFP cDNA中促进细胞分泌EGP。与PSG表达系统不同，绿色荧光蛋白EGFP在MSG细胞中，以非融合蛋白形式表达，并分泌到蚕茧的丝胶层中，将蚕茧浸入到中性水溶液中可以方便的回收丝胶层中的EGFP，且不丧失其生物活性。上述的研究表明，与PSG相比，MSG表达系统有很多优势。首先，重组蛋白以非融合蛋白的形式表达，因此无需蛋白酶处理便可收集。第二，通过将蚕茧浸入中性溶液中，便可从中提取重组蛋白，且不丧失重组蛋白的生物活性。第三，从蚕茧中提取的重组蛋白，只带有少量的内源性丝蛋白，有利于后续的纯化。

Ogawa等［17］通过利用增强子hr3连接Ser1启动子和IE1基因，在转基因家蚕的MSG细胞中表达重组人类血清白蛋白（HSA）。转基因家蚕丝的丝胶层中含有重组HSA，浓度为3 μg/ml，蚕茧中的重组HSA可用PBS提取，然后进行硫酸铵沉淀和用琼脂糖柱进行亲和层析。纯化的重组HSA的光谱与来源于血清的天然HSA一致，表明重组HSA的二级结构、三级结构与天然HSA一致。重组HSA的药物结合性试验结果也表明：重组HSA的药物结合性与天然HSA非常相似，证明转基因家蚕可以合成在结构和功能上与天然HSA一致的重组HSA。

段建平等［18］利用Ser1启动子，以EGFP为筛选标记，将人脑源性神经营养因子（human brain-derived neurotrophic factor，hBDNF）基因重组到piggyBac载体并利用显微注射到蚕卵中，在中部丝腺中获得了较高水平的表达。

Wang等［19］通过与Ser1启动子连接增强子，利用MSG表达系统高效表达了重组人酸性纤维母细胞生长因子，生物活性实验证明其有较高的生物活性，表明在家蚕丝腺中生产具有生物活性的重组蛋白是切实可行的。

胶原蛋白是一种由三条α链组成的三螺旋蛋白。因为家蚕丝腺脯氨酰羟化酶活性低［20］，家蚕合成的重组α1（I）链不含有形成胶原蛋白三螺旋所需要的羟基脯氨酸，因此，重组α1（I）链并没有按照设想的形成三螺旋结构。为了提高脯氨酰羟化酶的活性，Adachi等［21］把Ser1启动子驱动脯氨酰羟化酶α亚基基因的piggyBac质粒用显微注射法导入家蚕，获得了脯氨酰羟化酶α亚基和人胶原蛋白同时在后部丝腺中分泌表达的转基因家蚕，使脯氨酰羟化酶的活性提高了130倍，生产出I型胶原蛋白［α1（I）-chain］三螺旋α1-链。

小鼠单克隆抗体（mAb）分子IgG mAb由两种多肽链组成，25-KDa的L链和50-KDa的H链。链的成分为L2H2。每条L链通过二硫键与H链连接，H链通过其它二硫键与其它H链结合。为了在家蚕中研究这种相当复杂的分子合成过程，制作了三种转基因株系，L-，H-，和L/H-，分别对应合成小鼠IgG L-链，H-链，或者L-和H-链［22］。L-系家蚕分泌L-链，以单体形式进入蚕茧，而H-系家蚕分泌H-链，以二聚体和更高的分子复合物形式。在L/H系种，共表达的L-和H-链完全形成L2H2进入蚕茧中。在L/H系的蚕茧中几乎检测不到L-链单体或者H-链二聚体的存在。在L/H系的蚕茧中的H-链的含量大约是H-蚕茧的2.3倍。据此，家蚕的MSG细胞表达系统可合成并分泌带有L2H2结构的重组mAb这种复杂分子的合成。在脊椎动物生产抗体的细胞中，通过L2H2能否有效合成并从细胞中分泌来判定mAb的合成分泌质量。

3 目前存在的问题和前景展望

家蚕丝腺作为一个天然高效合成蛋白质的生物反应器，对于生产在畜牧、兽医科学、生物技术和制药领域广泛应用的重组蛋白有着重要作用。随着对家蚕转基因技术不断探索与研究，转基因技术体系将日趋成熟，在制作方法、载体、报告基因等方面都有了很大进展，获得转基因家蚕的成功率也越来越高，转基因家蚕的应用将会越来越广泛。利用转基因家蚕丝腺生物反应器生产重组蛋白虽然已经取得了重大进步，但是仍存在许多亟待解决的问题。丝腺生物反应器表达重组蛋白的效率不够高。例如表达系统的效率，密码子使用偏向性，靶基因的复制数量，周围基因组DNA对靶基因的位置效应等等。对于提高重组蛋白的表达水平也做了一些努力。包括，在PSG中过表达Ras1CA致癌基因能够有效提高60%丝蛋白产量和蚕丝产量［23］，这对于提高重组蛋白的产量或许有所帮助。重组蛋白纯化费用高昂，如何降低重组蛋白纯化成本是决定能否工业化、商品化的关键。从可溶丝胶蛋白中提取重组蛋白比从不溶丝素蛋白中提取简单，采用丝胶表达系统来生产重组蛋白用于后续纯化，是最好的选择，而丝蛋白表达系统更倾向于生产生物材料用的修饰丝纤维。重组蛋白的生物活性需要进一步提高。与哺乳动物相比，家蚕丝腺拥有相似的转录后修饰的模式与能力，如糖基化、磷酸化、蛋白质修饰，然而，重组人类胶原蛋白的例子证明，不是所有通过家蚕丝腺生产的重组蛋白都具有生物活性，这是蛋白质修饰不够造成的，需进一步深入研究转录后修饰将使我们明白哪些重组蛋白适合在家蚕丝腺中生产。

利用家蚕丝腺巨大的蛋白合成能力，通过转基因技术构建的家蚕丝腺生物反应器是一种安全、高效地生产重组蛋白的较好系统，目前，已经发展了五种利用Ser1启动子、Fib-L启动子、Fib-H启动子和糖蛋白（P25）启动子等在家蚕MSG或者PSG表达重组蛋白的表达系统。已经成功表达了多种生物活性蛋白，这其中包括生长因子，细胞因子，单克隆抗体，疫苗和胶原蛋白等等。与昆虫、酵母和哺乳动物细胞表达系统相比，家蚕作为比较高级的真核生物，对于其遗传基础的研究也已非常充分，因此可作为生产重组药物蛋白的理想宿主。生产可作为生物材料的经修饰丝纤维。带有高抗菌性、高力学性，生物降解性，生物兼容性和其他特性的蚕丝生物材料，在骨骼、皮肤、软骨、韧带、血管、神经、眼睛、心脏，和膀胱组织等具有广泛的生物工程应用。通过在丝腺中导入各种功能的DNA片段，便可利用家蚕作为生物反应器大规模生产这种生物材料。生产作为织物材料的经修饰丝纤维。天然的丝纤维具有很多显著特性，但是也存在很多缺点，例如，易褶皱，易褪色，难梳理，难纺织，这些问题都是由其分子机制决定的。进行基因修饰是解决上述问题的有效途径。已经证明在转基因家蚕中生产高机械性能的改良丝纤维是切实可行的。在不远的将来，越来越多通过转基因家蚕生产的经基因修饰的丝纤维和新丝产品将面世，不断丰富和美化我们的日常生活。

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The Perspective of Recombinant Protein Production Using the Silk Gland as a Bioreactor

HUANG Shao-hua1,DONG Jiu-ming2,LIU Yun-cai1,ZHAN Peng-fei3
（1.College of Animal Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China; 2.Zhejiang Provincial Technology Extension Center,Hangzhou 310029,China; 3.Huzhou Academy of Agricultural Sciences,Huzhou 313000 Zhejiang,China）

The silk gland of silkworm Bombyx mori has the excellent ability of synthesizing silk proteins.To utilize such capacity for mass production of useful proteins,transgenic silkworms were generated that synthesized recombinant proteins in the silk gland and secreted them into the silk cocoon.These recombinant proteins can be widely used in the biological,biotechnical and pharmaceutical applications.By controlling the expressed regions of the recombinant protein in the silk gland,Expression in the PSG or MSG led to localization in the insoluble fibroin core or hydrophilic outer sericin layer,respectively.This review focuses on using the silk gland of silkworm Bombyx mori as a bioreactor,and the possibility of utilizing it as a valuable tool for the mass production of therapeutic and industrially relevant recombinan proteins.The challenges and perspectives of recombinant protein production are also discussed.

Bombyx mori;transgenic silkworm;silk gland-bioreactor;recombinant protein

S881

A

0258-4069［2015］04-015-05

湖州市科技计划（公益性技术应用研究）项目（No.2013GZ06），浙江省科技计划项目（No.2014C32076），浙江省三农六方科技协作项目。

黄绍华（1992-），男，硕士研究生，主要从事蚕基因工程研究。E-mail：1035131921@qq.com

占鹏飞，男，农艺师。E-mail：fei2533817@163.com