大蒜素防治大鼠肝纤维化的效果及其机制探讨

叶静，周晓明，张立，王璐璐，刘清华

(1石河子大学医学院，新疆石河子832003;2上海市徐汇区康健街道社区卫生服务中心;3石河子大学医学院第一附属医院)

大蒜素的化学名为二烯丙基三硫化物，是大蒜的主要有效成分，在抗病原微生物、抗肿瘤、提高机体免疫力、预防心脑血管疾病、抗氧化等方面具有多种药理作用［1，2］。近年来少数体内研究表明，大蒜素具有抗肝纤维化的作用，与下调炎症因子和细胞外基质(ECM)水平有关，但其作用机制尚不明确［3，4］。相关文献报道，采用四氯化碳(CCl4)腹腔注射法制备大鼠肝纤维化模型，于实验第4周开始即可有不同程度的肝纤维化改变;而且该模型病理特征稳定，在病理生理学方面与人类肝纤维化较为相似［5，6］。2013年12月～2014年2月，我们采用这种方法制备大鼠肝纤维化模型，并分别于造模开始及造模第5周予以大蒜素干预治疗，观察其对大鼠肝纤维化的保护效果。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar大鼠45只，雌雄各半，体质量220～260 g，由南方医科大学实验动物中心提供。大蒜素软胶囊(批号13050602)购于新疆华世丹药业有限公司，CCl4购于广州万从化工有限公司。ALT、AST、生长转化因子β(TGF-β)酶联免疫检测试剂盒购于广州佰而林生物科技有限公司，Thermo Multiskan Mk3型酶标仪购于美国赛默飞世尔科技公司，Olympus BX-51显微镜购于日本 Olympus公司。

1.2 造模与分组处理 将45只大鼠随机分为空白对照组6只、溶剂对照组7只、模型组8只、小剂量预防组8只、中剂量预防组8只及中剂量治疗组8只。大鼠肝纤维化模型的建立参照赵松峰等［5］的方法，用植物油将CCl4、大蒜素分别配成40%的油溶液和相应浓度。小、中剂量预防组及中剂量治疗组均给予CCl4油溶液1 mL/(kg·次)腹腔注射，2次/周，共8周;同时小、中剂量预防组于造模开始即分别给予大蒜素11、22 mg/(kg·d)灌胃，共8周;而中剂量治疗组则于造模后第5周开始给予大蒜素22 mg/(kg·d)灌胃，共4周。空白对照组不做任何处理，自由饮食、饮水。溶剂对照组给予等量植物油灌胃及腹腔注射，模型组给予等量植物油灌胃、CCl4油溶液腹腔注射。所有大鼠喂养标准食料，自由饮水。

1.3 血清ALT、AST、TGF-β检测 8周后于腹主动脉取血，制备血清。采用ELISA法检测各组血清ALT、AST、TGF-β，严格按照试剂盒说明书操作。

1.4 肝脏组织学观察 腹主动脉取血后，处死大鼠，解剖后肉眼观察肝脏组织的外观形态学改变。取肝脏左叶，常规甲醛固定，乙醇逐级脱水，石蜡包埋、切片，行HE染色及Masson染色。于100倍光镜下观察肝细胞变性、胶原纤维增生程度。

1.5 肝细胞变性及胶原纤维增生程度评价方法参照顾宏图等［7］的评分方法，评价肝细胞变性及胶原纤维增生程度。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用LSD检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清ALT、AST、TGF-β比较 见表1。

表1 各组血清ALT、AST、TGF-β比较(±s)

表1 各组血清ALT、AST、TGF-β比较(±s)

注:与空白对照组比较，a P＜0.05，b P＜0.01;与溶剂对照组比较，c P＜0.05，d P＜0.01;与模型组比较，e P＜0.01;与小剂量预防组比较，f P＜0.01;与中剂量预防组比较，g P＜0.05。

6 7.79±0.45 4.63±0.27 21.18±5.57溶剂对照组 7 7.83±1.20 4.59±0.64 18.95±2.98模型组 8 36.85±2.77bd 19.01±1.40bd 101.42±10.96bd小剂量预防组 8 24.03±7.48bde 12.82±3.88bde 71.50±11.98bde中剂量预防组 8 14.23±4.53bdef 7.22±1.83acef 45.44± 9.45bdef中剂量治疗组 8 10.60±1.79ef 5.46±0.96ef 34.87±4.76空白对照组bdefg

2.2 肝脏组织学检查结果 肝脏组织染色结果显示，空白对照组及溶剂对照组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐;表现为肝细胞以中央静脉为中心，呈放射状排列，未见变性和坏死，仅在汇管区有少量胶原纤维表达。模型组肝小叶结构被破坏，汇管区纤维组织明显增生并伸入肝小叶将小叶分割，形成完全或不完全假小叶，小叶内肝细胞气球样变性广泛，部分肝细胞灶状坏死。小剂量预防组肝组织汇管区及小叶内仍可见较薄的纤维间隔形成，少数形成不完全的假小叶，肝小叶部分肝细胞气球样变性，少数点状坏死。中剂量预防组汇管区散在星芒状纤维组织增生，未形成明显纤维间隔，肝小叶内仍可见局灶性气球样变性的肝细胞。中剂量治疗组汇管区纤维组织增生，部分纤维间隔形成，但小叶结构大部分保存，仅见散在的肝细胞气球样变性。见插页Ⅰ图1。

图1 大鼠肝组织学观察（×100）

2.3 各组肝细胞变性及胶原纤维增生程度比较见表2。

表2 各组肝细胞变性及胶原纤维增生程度比较(分，±s)

表2 各组肝细胞变性及胶原纤维增生程度比较(分，±s)

注:与空白对照组比较，a P＜0.01;与溶剂对照组比较，b P＜0.01;与模型组比较，c P＜0.01。

组别 n 肝细胞变性程度 胶原纤维增生程度空白对照组6 0 0溶剂对照组7 0 0模型组 8 3.38±0.52ab 2.87±0.83ab小剂量预防组 8 1.50±0.76abc 1.75±0.71abc中剂量预防组 8 1.37±0.51abc 1.12±0.35abc中剂量治疗组 8 1.25±0.46abc 1.63±0.52abc

3 讨论

肝纤维化是肝脏受到损伤时的一种修复反应，是多种慢性肝病共有的病理改变，其特征为细胞外基质(ECM)合成增多而降解减少。肝纤维化的演进与多种炎症相关细胞因子有关，如IL-6、IFN-γ、TNF-α及TGF-β等，炎症相关细胞因子调控失衡是肝纤维化形成与发展的重要因素之一［8］。肝星状细胞(HSC)的激活被公认为肝纤维化发生、发展的关键环节，TGF-β在HSC激活并转化为肌成纤维细胞的过程中发挥着重要作用［9］。TGF-β既能够激活HSC，促进胶原、纤维连接蛋白、蛋白多糖等ECM主要成分的合成，又能促进HSC分泌金属蛋白酶抑制剂，减少ECM的降解，使ECM的合成与降解失衡，从而加速肝纤维化的发展。

本研究结果显示，各组血清TGF-β比较，模型组＞小剂量预防组＞中剂量预防组＞中剂量治疗组＞空白对照组、溶剂对照组(P均＜0.05)。说明大蒜素能明显下调 CCl4所致的肝纤维化大鼠血清TGF-β，并且其疗效可能有一定的剂量依赖性。D' Argenio等［10］对CCl4诱导2周的肝纤维化大鼠给予大蒜提取物处理后，发现其血清TGF-β、ALT等均明显下降，这与我们的研究结果相一致，但并不能明确是大蒜提取物中的何种成分发挥了该药理作用。本团队前期研究结果亦显示，大蒜素具有抑制HSC增殖和促进 ECM降解的作用［11，12］。上述结果均提示，大蒜素对肝纤维化具有预防兼治疗的作用，其机制可能与下调相关炎症因子的表达水平有关。

ALT是反映肝功能受损最灵敏的指标，而AST的升高提示肝功能严重受损。当肝细胞发生变性、坏死或细胞膜通透性增强时，细胞内ALT、AST即释放入血，二者的水平可反映出肝功能受损程度。本研究中，肝纤维化大鼠经大蒜素干预治疗后，血清中的ALT、AST水平均明显下降，表明大蒜素具有保护肝细胞的作用，与本团队前期研究结果相符［13］。本实验病理组织观察结果显示，经大蒜素干预治疗后，肝纤维化大鼠肝细胞变性坏死、炎症程度明显减轻，肝组织内胶原纤维明显减少，肝小叶结构也有所恢复。这与朱兰香等［4］的研究结果相一致，均提示大蒜素具有减轻肝细胞损伤的作用。

因此，中等剂量的大蒜素即可较好地防治大鼠肝纤维化，可能与其抑制炎性反应及防止肝细胞变性有关。提示大蒜素在预防及治疗肝纤维化的过程中具有积极的作用，可能会成为治疗肝纤维化的一种新选择。

［1］刘清华，王璐璐.大蒜素治疗肝病的药理机制［J］.山东医药，2013，53(29):96-97.

［2］鲁锐，项标，刘静文，等.大蒜素的临床应用研究进展［J］.时珍国医国药，2013，24(3):711-713.

［3］朱兰香，陈卫昌，许春芳，等.大蒜素对大鼠肝纤维化模型细胞因子变化的影响［J］.江苏医药，2004，30(7):535-535.

［4］朱兰香，陈卫昌，刘世增，等.大蒜素对实验性大鼠肝纤维化的作用研究［J］.中华消化杂志，2003，23(7):441-443.

［5］赵松峰，阚全程.六味五灵片对四氯化碳致大鼠肝纤维化的保护作用［J］.中国药理学通报，2011，27(6):872-875.

［6］周贤，刘翼，夏国栋，等.肝纤维化动物模型探讨［J］.四川动物，2010，29(1):114-115.

［7］顾宏图，胡义扬，徐列明，等.扶正化瘀方预防实验性肝纤维化组织学观察［J］.中西医结合肝病杂志，1997，7(4):224.

［8］Elsharkawy AM，Oakley F，Mann DA.The role and regulation of hepatic stellate cell apoptosis in reversal of liver fibrosis［J］.Apoptosis，2005，10(5):927-939.

［9］Odena G，Bataller R.Liver fibrogenesis:physiopathology［J］.Gastroenterol Hepatol，2012，35(2):3-9.

［10］D'Argenio G，Mazzone G，Ribecco MT，etal.Garlic extractattenuating rat liver fibrosis by inhibiting TGF-β［J］.Clin Nutr，2013，32(2):252-258.

［11］刘金玲，郑勇，刘清华.大蒜素对大鼠肝星状细胞增殖的影响［J］.临床和实验医学杂志，2014，13(3):141-165.

［12］周晓明，刘金玲，王璐璐，等.大蒜素对大鼠肝星状细胞基质金属蛋白酶抑制剂-1表达的影响［J］.广东药学院学报，2013，29 (6):351-354.

［13］潘冬梅，郑勇，刘清华，等.大蒜素辅助治疗肝纤维化效果观察［J］.山东医药，2013，53(20):48-50.