不同地理种群麦长管蚜3种次级共生菌检测与系统发育分析

罗 晨， 胡祖庆，于永昂，杨 杰，张改生，赵惠燕

(西北农林科技大学 a 旱区作物逆境生物学国家重点实验室 植物保护学院，b 国家杨凌农业生物技术育种中心,国家小麦改良中心杨凌分中心,小麦育种教育部工程研究中心,陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室，陕西 杨凌 712100)

不同地理种群麦长管蚜3种次级共生菌检测与系统发育分析

罗 晨a， 胡祖庆a，于永昂b，杨 杰a，张改生b，赵惠燕a

(西北农林科技大学 a 旱区作物逆境生物学国家重点实验室 植物保护学院，b 国家杨凌农业生物技术育种中心,国家小麦改良中心杨凌分中心,小麦育种教育部工程研究中心,陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室，陕西 杨凌 712100)

【目的】 次级共生菌Serraticsymbiotica(PASS)、Hamiltonelladefensa(PABS)、Regiellainsecticola(PAUS)广泛存在于蚜虫体内。研究其在我国麦长管蚜(Sitobionavenae(Fabricius))体内的感染情况及遗传多样性，为进一步研究感染次级共生菌对麦长管蚜的生态学和生物学影响奠定基础。【方法】 利用16S rDNA特异引物，对陕西杨凌、安徽滁州、陕西五丁关、河南郑州、山西太谷和新疆石河子6个地理种群麦长管蚜体内PASS、PABS和PAUS共生菌进行了Long-PCR检测、测序和系统发育分析。【结果】 (1)所有6个地理种群均感染PASS和PAUS(感染率均为100%)，而陕西杨凌、安徽滁州、新疆石河子3个地理种群感染PABS(感染率15%～70%)，其余3个地理种群均未感染PABS。(2)16S rDNA序列的比对分析表明，感染PASS、PABS和PAUS的6个地理种群的株系均具有高度一致的序列。(3)基于16S rDNA 序列构建的系统发育树表明，我国麦长管蚜体内感染的这3种次级共生菌中，PASS和PABS共生菌的亲缘关系较近。【结论】 PASS和PAUS广泛存在于中国不同地理种群麦长管蚜体内，且具有较低的遗传多样性。

麦长管蚜；地理种群；次级共生菌；系统发育分析；16S rDNA

昆虫体内次级共生菌Serratiasymbiotica(PASS)、Regiellainsecticola(PAUS)和Hamiltonelladefensa(PABS)均属于γ-变形门菌[1-4]。它们对宿主昆虫的生长和生活虽不是必需的，但在宿主抵御逆境胁迫时具有重要的作用。PASS可以帮助寄主抵抗高温[5-6]；PAUS可以帮助寄主抵抗真菌和影响寄主的取食行为[7-8]；PABS能保护宿主昆虫抵抗天敌[9-12]。次级共生菌在自然种群中既可以垂直传播，也可以水平传播[13-16]。昆虫体内可以含有一种或多种次级共生菌[17-18]。美国加利福尼亚当地超过80%的昆虫体内都可以检测到PASS；日本超过35%的昆虫体内含有PASS[19-20]。在中国，对昆虫体内次级共生菌Rickettsia和Wolbachia的检测已经开始[21-22]，但有关上述3种(PASS、PAUS和PABS)次级共生菌的检测还未见报道，而次级共生菌的检测是研究其对宿主昆虫生态学和生物学影响的基础。目前,16S rDNA被普遍用于次级共生菌的检测和序列分析[23]。

麦长管蚜(Sitobionavenae(Fabricius))属半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)，是小麦生育期最重要的世界性害虫类群之一。麦长管蚜为害对小麦的产量和品质影响显著[24-25]。麦长管蚜除直接吸食植物的汁液、分泌蜜露影响植物光合作用外，还能传播多种植物病毒病。国外研究表明，麦长管蚜体内存在次级共生菌[26]，并且麦长管蚜与其体内共生菌已建立了互利共生的关系[27]，但目前我国有关麦长管蚜体内次级共生菌种类、分布及功能研究尚未见相关报道。

次级共生菌对宿主蚜虫的生物学与生态学具有重要影响，是研究共生关系的模型，已成为广大学者研究的热点。为了揭示我国不同地理种群麦长管蚜体内次级共生菌的感染情况，本研究利用次级共生菌PASS、PAUS和PABS的16S rDNA基因特异引物，对我国6个地理种群麦长管蚜进行Long-PCR检测，并对检测结果进行比较；对感染个体体内次级共生菌的16S rDNA基因片段进行了测序，构建系统发育树，为进一步研究感染次级共生菌对麦长管蚜的生态学和生物学影响奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 供试虫源

试验所用的麦长管蚜分别采自我国陕西杨凌(34.36°N,108.72°E)、安徽滁州(32.33°N,118.31°E)、陕西五丁关(32.83°N,106.25°E)、河南郑州(34.46°N,113.40°E)、山西太谷(34.36°N,110.15°E)和新疆石河子(44.18°N,86.00°E)6个地理种群，每个地理种群采集3个样点。由于蚜虫具有孤雌生殖的特征，为了避免采集到同一母蚜所产的后代，采集时尽量使样点之间相隔至少10 m。用无水乙醇浸泡采集到的成虫，保存在-20 ℃条件下备用。

1.2 麦长管蚜总DNA 的提取

取麦长管蚜,用无菌水清冼2次，每次2 min。本试验采取单头单提，每个地理种群提取20头。使用DNA提取试剂盒提取DNA(庄盟生物，北京)。对提取的DNA进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。-20 ℃保存备用。

1.3 PASS、PAUS和PABS共生菌检测

分别利用PASS、PAUS和PABS共生菌的16S rDNA基因的特异引物(根据已知豌豆蚜体内共生菌的保守序列设计,引物序列见表1),对6个不同地理种群麦长管蚜体内共生菌进行Long-PCR检测。Long-PCR的扩增体系为20 μL：上、下游引物各1.5 μL(10 μmol/L),DNA模板3 μL，GoldstarTaqMan Mixture(CWBIO) 10 μL,RNase-Free Water 4 μL。Long-PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s(循环10次，每个循环温度降低0.5 ℃),72 ℃延伸1 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s(循环30次)(PASS、PAUS的退火温度增加至67 ℃),72 ℃延伸1 min；最后，72 ℃延长10 min。扩增产物全部用于琼脂糖凝胶电泳(PASS、PAUS用2.0%的琼脂糖凝胶；PABS用1.0%琼脂糖凝胶)检测，用凝胶成像系统拍照记录，然后用DNA胶回收试剂盒进行胶回收(庄盟生物，北京)，测序。

1.4 系统发育树分析

感染次级共生菌的所有蚜虫个体的DNA均进行PCR扩增和胶回收产物测序，得到16S rDNA 序列。将测序结果拼接后在NCBI上进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索，以确保获得的序列片段为16S rDNA 基因的序列片段。用DNAman 软件对6种不同地理种群同源基因进行比对分析，并从GenBank 基因数据库中检索相关蚜虫体内相同共生菌序列相似性较高的16S rDNA 序列并下载。同时，使用MEGA5.0基于Maximum Composite Likelihood 模型计算序列间的遗传距离，构建系统发育树，系统树各分支的置信度( bootstrap) 均进行1 000 次重复检验。

2 结果与分析

2.1 麦长管蚜不同地理种群体内共生菌的感染情况

利用16S rDNA基因对我国6个地理种群麦长管蚜共计120头个体感染情况的检测结果见表2。由表2可以看出，麦长管蚜体内PASS、PAUS共生菌的感染率均为100%。PABS共生菌在安徽滁州、陕西杨凌和新疆石河子的感染率分别为70%，30%和15%，但在陕西五丁关、河南郑州和山西太谷3个地理种群均没有检测到PABS共生菌。

2.2 地理种群间PASS、PAUS和PABS共生菌序列差异

安徽滁州、陕西五丁关、河南郑州、新疆石河子、陕西杨凌和山西太谷的PASS、PAUS共生菌16S rDNA序列已上传至GenBank，其中PASS的序列号分别为KM035988、KM035989、KM035990、KM035991、KM035992、KM035993，PAUS的序列号分别为KM035994、KM035995、KM035996、KM035997、KM035998、KM035999。陕西杨凌、安徽滁州和新疆石河子的PABS共生菌16S rDNA序列也已上传至GenBank，序列号分别为KM036000、KM036001、KM036002。

测序结果表明，PASS共生菌16S rDNA片段在安徽滁州、陕西五丁关、河南郑州、山西太谷和陕西杨凌5个地理种群的碱基序列完全一致；而与其他5个地理种群的碱基序列相比，新疆石河子的碱基序列在第5，68位上的碱基存在差异(新疆石河子的碱基均为G,其他地理种群的均为A)，在第21、43位上，新疆石河子的序列分别多出了1个C和G碱基。 通过DNAman对其不同基因序列进行相似性分析认为，安徽滁州、陕西五丁关、河南郑州、山西太谷和陕西杨凌这5个地理种群的碱基序列与新疆石河子的碱基序列的相似度为98.28%。

测序结果表明，PAUS共生菌 16S rDNA片段在陕西五丁关和陕西杨凌的碱基序列完全一致；河南郑州和新疆石河子的碱基序列完全一致。6个地理种群间的碱基序列差异主要发生在49，122，133和140位点上。通过DNAman对其不同基因序列进行相似性分析认为，不同地理种群麦长管蚜基因间最大相似度为99.50%，最小相似度为97.99%。

PABS共生菌16S rDNA片段的测序结果表明：陕西杨凌和安徽滁州476，704位点上的碱基有差异(陕西杨凌的分别是G、T， 安徽滁州的分别是C、C)；陕西杨凌和新疆石河子相比，只在1 037位点上有差异(分别是G、T)；安徽滁州和新疆石河子相比，在476，704和1 037位点上有差异(安徽滁州的分别是C、C、G， 新疆石河子的分别是G、T、T)。通过DNAman对其不同基因序列进行相似性分析认为：不同地理种群麦长管蚜基因间最大相似度为99.92%，最小相似度为99.77%；新疆石河子与烟粉虱体内相同共生菌的相似度为89.07%，与豌豆蚜体内相同共生菌的相似度为94.84%，与黑豆蚜体内相同共生菌的相似度为95.66%。

通过以上分析认为，6个地理种群的PASS、PAUS和3个地理种群的PABS共生菌基因序列相似性极高，相似性最小的为97.99%。共生菌研究中若相似性大于97.5%的株系即可归为一类。因此，认为不同地理种群体内的PASS、 PAUS 和 PABS共生菌均为单菌系。

将测序所得序列导入NCBI BLAST，结果证实为PASS、PAUS和PABS共生菌的16S rDNA基因序列。通过MEGA5.0 软件采用NJ邻接法建立系统发育树(图1)，发现各地理种群的PASS、PAUS和PABS共生菌分别与其自己本身相似的共生菌聚集在一起。从图1可以看出，PASS和PABS共生菌的亲缘关系较近。本试验使用最大相似度法(ML)和最小进化法(ME)构建的系统发育树结果相似。

由图1还可以看出，6个地理种群的PASS共生菌的亲缘关系较近，特别是安徽滁州、陕西五丁关、河南郑州、山西太谷、陕西杨凌的PASS共生菌的碱基序列都完全一样。6个地理种群的PAUS共生菌的亲缘关系较近，其中新疆石河子、河南郑州和山西太谷的PAUS共生菌的亲缘关系更为接近，安徽滁州、陕西五丁关和陕西杨凌的PAUS共生菌的亲缘关系更为接近；本研究中新疆石河子和河南郑州麦长管蚜的PAUS共生菌与来自德国的麦长管蚜的PAUS共生菌的16S rDNA序列完全一样,而与来自英国的麦长管蚜的PAUS共生菌的16S rDNA序列亲缘关系较远。陕西杨凌、安徽滁州和新疆石河子3个地理种群麦长管蚜的PABS共生菌亲缘关系较近；所有蚜科的PABS共生菌与烟粉虱(Bemisiatabaci)PABS共生菌的亲缘关系较远。

3 讨 论

PASS、PAUS和PABS共生菌在豌豆蚜中的研究技术已经成熟[1-12]，而我国麦长管蚜次级共生菌分布状态尚未见报道。本研究对中国不同地理种群麦长管蚜体内3种次级共生菌PASS、PAUS和PABS进行了检测，结果发现，我国不同地理种群麦长管蚜体内的次级共生菌均存在多重感染，这与国外报道的麦长管蚜体内同时含有7种常见次级共生菌的至少3种的结果是一致的[28]。PASS和PAUS共生菌在中国的6个地理种群的感染率均为100%，而日本种群的感染率分别为38.7%和16.0%[20]，说明PASS和PAUS共生菌在中国的麦长管蚜体内的感染率高于日本，这可能是由于日本和中国的地理位置不同所致，也可能是PASS和PAUS共生菌在自然界中存在水平转移现象所致。PABS 共生菌只在安徽滁州、陕西杨凌和新疆石河子3个地理种群中被发现，而在陕西五丁关、河南郑州和山西太谷这3个地理种群中没有检测到，且3个感染PABS 共生菌的地理种群的感染率均较低。推测其原因可能是：(1)蚜虫体内所感染次级共生菌的种类和感染率与地理位置有关；(2)PABS共生菌在我国麦长管蚜体内的感染率普遍较低。豌豆蚜体内最常见的次级共生菌是PABS 共生菌[28]，而在本研究的结果是PASS 和 PAUS共生菌的感染率高，而PABS的感染率相对很低，可能是因为不同种间蚜虫的感染情况是不同的，其具体原因还有待进一步研究。

本研究中PABS共生菌在安徽滁州、陕西杨凌和新疆石河子的感染率分别为70%，30%和15%，而安徽滁州、陕西杨凌和新疆石河子分别位于中国的西部、中部和东部。不难发现，本试验中，PABS共生菌在中国麦长管蚜体内的感染率由西部向东部依次降低，推测PABS共生菌的感染率与地理位置和自然环境有着密切关系，特别是与海拔有关，因此在研究麦长管蚜遗传分化的过程中，选择样本时应考虑地理位置、自然环境等因素。由于本试验地理种群较少，还不能完全得出上述结论，需要进一步试验验证。

本研究在麦长管蚜的有翅型和无翅型个体中都检测到PASS、PAUS和PABS共生菌的存在，说明这3种共生菌普遍存在于不同地理种群的有翅型和无翅型麦长管蚜个体中，但有翅型和无翅型麦长管蚜个体间的PASS、PAUS和PABS共生菌的基因差异是否大于有翅型麦长管蚜个体间或无翅型麦长管蚜个体间，这3种共生菌在有翅型和无翅型麦长管蚜体内存在的部位是否相同，还有待进一步深入研究。

本研究的这3种次级共生菌中，PASS与PABS共生菌的亲缘关系明显较近，根据DNAman基因序列相似度也证明了这一点；对PABS来说，本试验所采用的麦长管蚜体内共生菌的亲缘关系要高于其他种，通过DNAman对其不同基因序列进行相似性分析认为：不同地理种群麦长管蚜基因间最大相似度为99.92%，最小相似度为99.77%，而新疆石河子与烟粉虱体内相同共生菌的相似度为89.07%，与豌豆蚜体内相同共生菌的相似度为94.84%，与黑豆蚜体内相同共生菌的相似度为95.66%，说明不同种间蚜虫体内次级共生菌基因存在差异。

本试验每个地理种群的20个个体采取的试验方法、条件和手段完全相同，但Long-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后条带的亮度差异明显，通过核酸浓度测定仪所得结果也是差距较大，推测即使同一地理种群麦长管蚜不同个体间所含的同一种共生菌的数量是不同的。

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此类方法的应用目的是能够提升学生良好语感，并可以在听的过程中吸收不同文化内涵。且可以掌握单词的发音与韵律。英语启蒙学习的过程中需要能够帮助学生掌握足有的语音信号，只有这样才能够有助于帮助他们分辨不同信号。

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Detection and phylogenetic analysis of three facultative endosymbionts in grain aphid,Sitobionavenaefrom different geographical regions

LUO Chena,HU Zu-qinga,YU Yong-angb,YANG Jiea, ZHANG Gai-shengb,ZHAO Hui-yana

(aStateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas,CollegeofPlantProtection,bNationalYanglingAgriculturalBiotechnology&BreedingCenter,YanglingBranchofStateWheatImprovementCenter,WheatBreedingEngineeringResearchCenterMinistryofEducation,KeyLaboratoryofCropHeterosisofShaanxiProvince,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 Secondary symbionts,Serraticsymbiotica(PASS),Hamiltonelladefensa(PABS) andRegiellainsecticola(PAUS),exist widely in grain aphid,which induce changes in biological and ecological characteristics of aphids.This paper researched the genetic diversity and phylogeny of PASS,PABS and PAUS in 6 geographical populations ofSitobionavenaein wheat in China.【Method】 Special primers of 16S rDNA were used to conduct Long-PCR detection,sequence analysis,and phylogenetic analysis for PASS,PABS and PAUS in 6 geographical regions including Yangling Shaanxi,Chuzhou Anhui,Wudingguan Shaanxi,Zhengzhou Henan,Taigu Shanxi,and Shihezi Xinjiang.【Result】 (1) All 6 geographical populations ofS.avenaewere infected by PASS and PAUS with the infection rate of 100%,andS.avenaepopulations from Yangling Shaanxi,Chuzhou Anhui,and Shihezi Xinjiang were also infected by PABS with the infection rate of 15%-70%.(2) The comparison of 16S rDNA gene sequences showed that the gene sequences of PASS,PABS,and PAUS from all 6 geographical populations were highly identical.(3) The phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA gene showed that PASS and PABS had close genetic relationship.【Conclusion】 PASS and PAUS existed diffusely inS.avenaepopulations from different geographical regions of China, and they had poor genetic diversity.

Sitobionavenae;geographical populations;facultative endosymbionts;phylogenetic analysis;16S rDNA

2014-07-24

陕西省科学技术研究发展计划项目(2013K02-12)；西北农林科技大学基本科研业务费专项(QN2013011)；西北农林科技大学博士后科研启动基金项目(2013BSJJ114)

罗 晨(1989-)，男，陕西咸阳人，硕士，主要从事昆虫体内微生物研究。E-mail：lczhibao@163.com

赵惠燕(1955-)，女，陕西铜川人，教授，博士生导师，主要从事昆虫生态学研究。E-mail：zhaohy@nwsuaf.edu.cn

时间:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.013

Q965.8

A

1671-9387(2015)01-0141-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.013.html