四川黑茶的高效液相色谱指纹图谱研究

胡 燕，齐桂年

(四川农业大学 园艺学院， 四川 雅安 625014)

四川黑茶的高效液相色谱指纹图谱研究

胡 燕，齐桂年

(四川农业大学 园艺学院， 四川 雅安 625014)

【目的】 应用高效液相色谱法(HPLC)研究四川黑茶的指纹图谱，为四川黑茶的鉴别和质量评价提供参考。【方法】 以四川省11个不同生产厂家的22个黑茶样品及我国其他黑茶主产区的13个黑茶样品为试验材料，采用线性梯度洗脱，以甲醇和体积分数2%乙酸水溶液为流动相，在柱温30 ℃，检测波长280 nm，流速1.0 mL/min条件下构建四川黑茶HPLC指纹图谱的共有模式，分析各样品与该共有模式的相似度，并对35个黑茶样品进行聚类分析。【结果】 确定了14个色谱峰为四川黑茶的共有峰；精密度、重现性、稳定性试验中各共有峰的相对峰面积、相对保留时间的相对标准偏差(RSD)均小于3.00%；22个四川黑茶样品与共有模式的相似度为0.825～0.978；对相对峰面积的聚类分析结果表明，当临界值为10时，35个来自全国不同产地的黑茶样品可聚为4类，来自四川的22个黑茶样品可聚为一大类。【结论】 根据构建的四川黑茶的HPLC指纹图谱，可以鉴定和评价除方包茶之外的四川黑茶。

四川黑茶；高效液相色谱法；化学指纹图谱；聚类分析

黑茶是我国六大茶类之一，属于后发酵茶，以边销为主，主产区为湖南、四川、云南、湖北、广西等省[1]。黑茶因产地、原料拼配比例和加工工艺等方面的差别，其内含物质如多酚类、咖啡碱、茶色素等的种类和含量均存在差异。四川黑茶是我国黑茶类的一个重要组成部分，其生产历史悠久，品种主要为南路边茶康砖、金尖和西路边茶茯砖、方包等。目前对四川黑茶的研究主要集中在品质化学成分[2-5]、加工过程中微生物种群的分离鉴定[6-7]和降氟技术[8]等方面；现有国家标准对四川黑茶品质的评价主要是测定水分、总灰分、水浸出物等理化指标并结合感官审评[9-11]，但难以全面反映其品质。

化学指纹图谱是指在固定的试验条件下，将待测物经适当处理后得到的能标示其化学特征的谱图[12]，可分为光谱指纹、色谱指纹、波谱指纹图谱以及采用多种现代分析仪器得到的多维多息特征谱等，其中高效液相色谱(HPLC)指纹图谱适用于分析茶叶中的非挥发性成分[13]。化学指纹图谱技术目前已广泛应用于中药的真伪鉴别、质量控制、新药开发等领域[14-16]，但应用于黑茶的研究较少[17-19]。因此，本试验初步构建了四川黑茶的HPLC指纹图谱，综合评价四川黑茶中非挥发性成分的化学特征，以期为四川黑茶的鉴别和质量的客观评价提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

22个(S1～S22)四川黑茶样品源自四川省的11个不同生产厂家，13个(S23～S35)对照样品分别采自云南、广西、湖北、湖南、陕西等黑茶的其他主产区，所有茶叶样品的生产年份均为2012年，详见表1。

1.2 仪器与试剂

主要仪器有：岛津LC-20A高效液相色谱仪(配有在线真空脱气装置、四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器)，LCsolution色谱工作站(日本岛津)，超声波清洗器(上海冠特超声波仪器有限公司)，电子天平(德国赛多利斯股份公司)，台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，电热恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)和微型植物实验粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

主要试剂有：色谱纯甲醇(美国Fisher公司)，二次蒸馏水，分析纯乙酸(天津科密欧化学试剂开发中心)，咖啡碱(CAF)、没食子酸(GA)、儿茶素(C)标准品(中国标准物质中心)。

1.3 样品前处理

称取2.00 g粉碎茶样(过40目筛, 筛孔孔径为0.425 mm)于250 mL具塞锥形瓶中，加入140 mL 90 ℃的蒸馏水，立即移入90 ℃水浴中浸提15 min，每隔5 min摇动1次。浸提完毕后，冷却至室温，离心15 min(转速4 000 r/min)，取上清液，用0.45 μm水相滤膜过滤后上机分析；同时，采用相同的色谱条件取CAF、GA、C标准品溶液上机分析。

1.4 色谱条件

流动相A为体积分数2%乙酸水溶液，流动相B为甲醇；色谱柱为汉邦科技Lichrospher C18色谱柱(5 μm×250 mm×4.6 mm)。检测波长280 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min。分析时间65 min。

梯度洗脱程序：0～8 min，3%～10%B；8～15 min，10%～17%B；15～20 min，17%～21%B；20～28 min，21%～24%B；28～33 min，24%～40%B；33～48 min，40%～70%B；48～60 min，70%～30%B；60～65 min，30%～3%B。系统平衡色谱柱时间为15 min。

1.5 方法学考察

取同一黑茶样品按1.3中的条件制备，在1.4中的色谱条件下连续进样6次，以7号峰为参照峰，考察仪器的精密度。

取同一黑茶样品5份，按1.3中的条件平行制备，在1.4中的色谱条件下分别进样检测，以7号峰为参照峰，考察试验方法的重现性。

取同一黑茶样品按1.3中的条件制备，分别放置0，2，4，8，12，16，20和24 h，然后按1.4中的色谱条件进样检测，以7号峰为参照峰，考察黑茶样品提取液的稳定性。

1.6 数据分析

将四川黑茶样品的HPLC图谱通过LCsolution色谱工作站以AIA格式导出，然后分别导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004 A版)软件中，生成四川黑茶的HPLC指纹图谱共有模式，计算四川黑茶样品及对照样品与四川黑茶共有模式的相似度；将22个四川黑茶样品及13个对照样品中各共有峰的相对峰面积与样品编号建立矩阵，采用SPSS 19.0软件，选择组间联接及连续变量的欧氏距离平方对供试黑茶样品进行聚类分析[20]。

2 结果与分析

2.1 黑茶HPLC指纹图谱方法的考察

在精密度试验中，HPLC图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.31%～1.28%和0.75%～1.96%，表明仪器的精密度良好。在重现性试验中，HPLC图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.22%～1.42%和0.75%～2.06%，表明试验方法的重现性良好。在稳定性试验中，HPLC图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.98%～2.04%和1.16%～2.29%，表明黑茶样品提取液在24 h内稳定。

2.2 四川黑茶HPLC指纹图谱的构建

四川省11个不同厂家22个黑茶样品的HPLC指纹图谱见图1，其HPLC指纹图谱共有模式见图2。选择出峰时间适中、峰面积在色谱图中所占比例较大,且在各个四川黑茶样品中均稳定存在的7号峰作为参照峰，分别计算各样品组分峰的相对保留时间，各组分峰按相对保留时间一一匹配后共确定14个共有峰。经与标准品比较，峰3、6、7分别鉴定为GA、C和CAF；22个四川黑茶样品各共有峰的平均相对保留时间见表2；分别计算13个对照茶样中各组分峰的相对保留时间并与四川黑茶比较，发现四川黑茶中的14个共有峰在对照茶样中均稳定存在，各色谱图中共有峰面积占总峰面积的比例均在90%以上。因此，仅通过四川黑茶共有峰不能将四川黑茶与我国其他产区的黑茶样品进行有效区分。

图1 22个四川黑茶样品的HPLC指纹图谱S1～S22.所示样品同表1
Fig.1 HPLC fingerprinting of 22 Sichuan dark tea samples S1-S22.Same as table 1

2.3 不同产地黑茶样品HPLC指纹图谱的相似度评价

从表3可以看出，22个四川黑茶样品与四川黑茶共有模式的相似度在0.825～0.978，除2个方包茶样品与共有模式的相似度较低外，其余20个样品的相似度均大于0.900，说明它们所含的化学成分相似，质量较稳定；其他省份的黑茶样品与四川黑茶共有模式的相似度在0.709～0.928，相似度的差异说明，不同产地、不同品种的黑茶样品由于加工工艺和原料的品种、嫩度等有别，其内含化学成分及含量可能存在一定的差异。

注：S1～S35.所示样品同表1。

Note:S1-S35.Same as table 1.

2.4 不同产地黑茶样品的聚类分析

从图3可以看出，当临界值为10时，35个来自不同产地的黑茶样品可聚为4类：来自四川的22个黑茶样品可聚为一大类，在这一大类中，加工工艺相同的10个康砖茶样品、8个金尖茶样品、2个方包茶样品分别聚为一小类，来自陕西咸阳的泾渭七子茯茶与四川茯砖茶聚为一小类，这与相似度的分析结果一致；来自湖南的6个黑茶样品聚为一大类；来自云南和湖北的4个黑茶样品聚为一大类；来自广西的2个六堡茶样品单独聚为一大类。不同黑茶样品中各共有峰相对峰面积的聚类分析结果表明，不同原料产地对黑茶内含化学成分的影响较大，可利用聚类分析对我国不同产地和加工工艺的黑茶样品进行初步区分。

3 讨 论

目前，对黑茶HPLC指纹图谱的研究主要集中于普洱茶，而对四川黑茶的HPLC指纹图谱研究尚未见报道。本试验初步构建了四川黑茶的HPLC指纹图谱，结果显示，22个四川黑茶样品均有14个共有峰，但峰面积存在差异，说明不同厂家、不同品种的四川黑茶样品，由于原料和生产工艺略有差异，造成其内含化学成分含量的不同；相似度分析结果表明，其他省份的黑茶样品与四川黑茶HPLC指纹图谱共有模式的相似度在0.709～0.928，因此仅通过四川黑茶中的共有峰及相似度评价，不能将四川黑茶与我国其他产区的黑茶样品进行准确区分，而将各共有峰的相对峰面积与样品编号建立矩阵后进行聚类分析能初步区分我国不同产地的黑茶样品。方包茶是四川西路边茶中的一个主要花色品种。本研究结果表明，2个方包茶样品与四川黑茶HPLC指纹图谱共有模式的相似度较低，这可能与原料及加工工艺不同有关，生产方包茶的鲜叶原料比南路边茶更为成熟，是采割1～2年生的成熟枝梢直接晒干制成，含梗量达60%。本试验采用HPLC指纹图谱分析技术，得到了有关四川黑茶质量的综合信息，比通过单一成分测定得到的结果更为丰富和全面；但与中药材相似，黑茶作为后发酵茶，其大多数活性成分都是次生代谢产物，本身就存在内在的不稳定性，这也是黑茶指纹图谱研究的难点，这就需要实施茶叶的规范化种植，并运用联用技术获得黑茶的多维多息特征谱，以更好地对黑茶物质基础进行研究。

4 结 论

本研究初步构建了四川黑茶的HPLC指纹图谱，22个四川黑茶样品中有20个样品与共有模式的相似度在0.902～0.978，而其他省份的黑茶样品与四川黑茶共有模式的相似度均较低；聚类分析也证实，来自四川的22个黑茶样品可聚为一大类。本研究结果在一定程度上为四川黑茶的鉴别和质量的客观评价提供了理论参考。

[1] 杨崇仁,陈可可,张颖君.茶叶的分类与普洱茶的定义 [J].茶叶科学技术,2006(2):37-38.

Yang C R,Chen K K,Zhang Y J.The classification of tea and the definition of Pu’er tea [J].Tea Science and Technology,2006(2):37-38.(in Chinese)

[2] 齐桂年,田 鸿,刘爱玲,等.四川黑茶品质化学成分的研究 [J].茶叶科学,2004,24(4):266-269.

Qi G N,Tian H,Liu A L,et al.Studies on the quality chemical components in Sichuan brick tea [J].Journal of Tea Science,2004,24(4):266-269.(in Chinese)

[3] 陈昌辉,郭金龙,汪艳霞,等.雅安藏茶制作工艺的品质变化 [J].林产化学与工业,2011,31(4):69-74.

Chen C H,Guo J L,Wang Y X,et al.Quality variation during the processing of Ya’an Tibet tea [J].Chemistry and Industry of Forest Products,2011,31(4):69-74.(in Chinese)

[4] 龚 雪,李银花,雷 雨,等.黑茶不同样品氨基酸组分的分析 [J].茶叶通讯,2010,37(4):9-12.

Gong X,Li Y H,Lei Y,et al.The comparison of amid acid in different kinds of dark tea [J].Tea Communication,2010,37(4):9-12.(in Chinese)

[5] 雷 雨.我国不同类别黑茶品质差异的研究 [D].长沙:湖南农业大学,2010.

Lei Y.A study on the quality differences of various dark teas in China [D].Changsha:Hunan Agricultural University,2010.(in Chinese)

[6] 付润华.康砖茶渥堆微生物及不同渥堆处理品质成分变化的研究 [D].四川雅安:四川农业大学,2008.

Fu R H.Study on the microorganism during pile-fermentation and the change of quality contents under different conditions of pile-fermentation to the Kangzhuan tea [D].Ya’an,Sichuan:Sichuan Agricultural University,2008.(in Chinese)

[7] 蒋玉玲.四川黑茶渥堆过程中优势真菌对其品质成分影响的研究 [D].四川雅安:四川农业大学,2012.

Jiang Y L.Study on the influence of advantage fungi to its quality components in the process of piled-fermentation of Sichuan brick tea [D].Ya’an,Sichuan:Sichuan Agricultural University,2012.(in Chinese)

[8] 罗学平.四川黑茶降氟技术与理论的研究 [D].四川雅安:四川农业大学,2007.

Luo X P.Study on the technologies and mechanisms of reducing fluorine in Sichuan brick tea [D].Ya’an,Sichuan:Sichuan Agricultural University,2007.(in Chinese)

[9] 吴锡端,骆少君,翁 昆,等.紧压茶:康砖茶 [S].北京:中国标准出版社,2002.

Wu X D,Luo S J,Weng K,et al.Brick tea:Kangzhuan tea [S].Beijing:National Standards of the People’s Republic of China,2002.(in Chinese)

[10] 吴锡端,骆少君,翁 昆,等.紧压茶:金尖茶 [S].北京:中国标准出版社,2002.

Wu X D,Luo S J,Weng K,et al.Brick tea:Jinjian tea [S].Beijing:National Standards of the People’s Republic of China,2002.(in Chinese)

[11] 吴锡端,骆少君,翁 昆,等.紧压茶:茯砖茶 [S].北京:中国标准出版社,2002.

Wu X D,Luo S J,Weng K,et al.Brick tea:Fuzhuan tea [S].Beijing:National Standards of the People’s Republic of China,2002.(in Chinese)

[12] 刘继平.指纹图谱质控技术对实现中药现代化的作用和意义 [J].陕西中医学院学报,2006,29(3):61-64.

Liu J P.Effect of the quality control technology of fingerprint on the realization of the modernization of traditional Chinese medicine [J].Journal of Shaanxi College of Traditional Chinese Medicine,2006,29(3):61-64.(in Chinese)

[13] Ma T T,Huang C,Meng X M,et al.Fingerprint analysis of Hawk-tea by high-performance liquid chromatography [J].Food Chemistry,2011,129(2):551-556.

[14] Tistaert C,Dejaegher B,Heyden Y V.Chromatographic separation techniques and data handling methods for herbal fingerprints:A review [J].Analytica Chimica Acta,2011,690(2):148-161.

[15] Yang D Z,An Y Q,Jiang X L,et al.Development of a novel method combining HPLC fingerprint and multi-ingredients quantitative analysis for quality evaluation of traditional Chinese medicine preparation [J].Talanta,2011,85(2):885-890.

[16] Xie B G,Gong T,Tang M H,et al.An approach based on HPLC-fingerprint and chemometrics to quality consistency evaluation of Liuwei Dihuang Pills produced by different manufacturers [J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2008,48(4):1261-1266.

[17] Zhang L,Li N,Che Y Y,et al.Development of the fingerprints of crude Pu-erh tea and ripened Pu-erh tea by high-performance liquid chromatography [J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,2011,20:352-359.

[18] 张铭光,袁 敏,袁 鹏,等.普洱茶热脱附-裂解色谱指纹图谱研究 [J].华南师范大学学报：自然科学版,2006(3):96-101.

Zhang M G,Yuan M,Yuan P,et al.Study on fingerprint of Pu-er tea by pyrolysis-gas chromatography [J].Journal of South China Normal University：Natural Science Edition,2006(3):96-101.(in Chinese)

[19] 王丽鸳,成 浩,周 健,等.普洱茶的HPLC化学指纹图谱分类研究 [J].浙江林业科技,2009,29(1):25-30.

Wang L Y,Cheng H,Zhou J,et al.Chemical fingerprints’classification of Pu’er tea by HPLC [J].Journal of Zhejiang Forestry Science and Technology,2009,29(1):25-30.(in Chinese)

[20] 倪永年.化学计量学在分析化学中的应用 [M].北京:科学出版社,2004.

Ni Y N.Application of chemical metrology in the analytical chemistry [M].Beijing:Science Press，2004.(in Chinese)

High performance liquid chromatographic fingerprinting of Sichuan dark tea

HU Yan,QI Gui-nian

(CollegeofHorticulture,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China)

【Objective】 The fingerprinting of Sichuan dark tea was studied using HPLC to improve its identification and quality assessment.【Method】 22 Sichuan dark tea samples from 11 different manufacturers and 13 dark tea samples from other regions of China were selected as experimental materials.A suitable chromatographic system was established using a linear gradient elution with methanol and water containing 2% acetic acid as the mobile phase,a detection wavelength of 280 nm and the flow speed of 1.0 mL/min.The common pattern of HPLC fingerprinting of Sichuan dark tea was established,and the similarity index between dark tea samples and the common pattern of Sichuan dark tea were analyzed.The methodology was inspected and cluster analysis of the 35 dark tea samples was conducted.【Result】 There were 14 peaks in chromatograms were determined.The RSD of the relative peak area and the relative retention time of common peaks in test of precision,repeatability,and stability were all less than 3.00%.The similarity index between 22 Sichuan dark tea samples and the common pattern of Sichuan dark tea ranged from 0.825 to 0.978.The cluster analysis on the relative peak area showed that the 35 dark tea samples from different origins could be divided into four types,and the 22 Sichuan dark tea samples belonged one same category.【Conclusion】 The established HPLC fingerprinting can be used to identify and evaluate Sichuan dark teas except Fangbao tea.

Sichuan dark tea;HPLC;chemical fingerprinting;cluster analysis

2013-09-18 [作者简介] 胡 燕(1982-),女，四川雅安人，工程师，在读博士，主要从事园艺植物资源开发与利用研究。

齐桂年(1956-)，男，重庆永川人，教授，博士，主要从事茶叶加工及植物资源开发与利用研究。

时间:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.012

TS272.7

A

1671-9387(2015)01-0134-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.012.html