蛋鸡抗IBV HI抗体效价与攻毒后产蛋性能的相关性

李新生，焦显芹，高文明，李双亮，张秀文，崔保安

(1 河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002；2 河南省出入境检验检疫局，河南 郑州 450003；3 浙江美保龙生物技术有限公司，浙江 金华 321017)

蛋鸡抗IBV HI抗体效价与攻毒后产蛋性能的相关性

李新生1，焦显芹1，高文明1，李双亮2，张秀文3，崔保安1

(1 河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002；2 河南省出入境检验检疫局，河南 郑州 450003；3 浙江美保龙生物技术有限公司，浙江 金华 321017)

【目的】 研究抗呼吸型IBV HI抗体水平与蛋鸡产蛋率的对应关系。【方法】 将180只SPF鸡分为4组，第1组和第2组首免用鸡传染性支气管炎H120活疫苗免疫，1羽份/只，4周后采血，第2组鸡同时用3批次的鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+HN6株)分别进行加强免疫，试验同时设置攻毒对照第3组和不免疫攻毒对照第4组。灭活疫苗免疫4周后，当产蛋率稳定在80%以上时，对试验鸡采血测定抗体，同时使用M41株病毒进行攻毒，记录攻毒后4周内各组鸡的产蛋性能，分析抗IBV HI抗体水平与攻毒后产蛋性能的相关性。【结果】 弱毒活疫苗和灭活疫苗联合免疫组抗IBV HI抗体水平在2-8.2～2-9.3时，免疫鸡能够耐受IBV强毒的攻击，其产蛋性能不受影响。弱毒活疫苗免疫组抗体为2-4.8，产蛋量下降了12.69%。攻毒对照组抗体水平为2-2.0，攻毒后产蛋量下降45.22%。【结论】 蛋鸡抗IBV HI抗体效价与产蛋率对鸡传染性支气管炎强毒的攻毒保护之间呈正相关，可以用HI抗体检测来评价鸡传染性支气管炎灭活疫苗对产蛋鸡的免疫效果。

IBV；HI抗体效价；攻毒；产蛋性能

传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道疾病，其特征是气管啰音、咳嗽和打喷嚏[1-2]。该病可侵害呼吸道、生殖道，造成产蛋鸡产蛋数量和蛋品质下降，是危害养鸡业健康发展的重要疫病之一[3-5]，因此做好IB的防控工作具有重要意义。

目前，在生产实践中，使用传染性支气管炎弱毒疫苗和灭活疫苗免疫接种被认为是预防控制IB流行的有效手段[6]。IB疫苗免疫效果的评价手段较多，如观察气管环纤毛保护情况、经鸡胚进行病毒分离鉴定[7-8]、攻毒后观察鸡产蛋性能或攻毒后观察临床症状[8]等。上述方法耗时繁琐，且因操作条件、试验动物级别等难以标准化，使检验结果可能会有较大误差。随着商品化IBV HI抗原的应用，使得利用血清学方法代替攻毒试验、病毒分离鉴定等对传染性支气管炎疫苗免疫效果的评价成为可能。为了了解鸡血清中抗IBV HI抗体效价与攻毒后产蛋性能之间的相关性，本研究参考文献[9-11]中的方法，用鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+HN6株)(以下简称“三联疫苗”)免疫SPF鸡，分析抗IBV HI抗体效价与攻毒后产蛋性能的相关性，以期证实血清学检验方法与攻毒试验之间的平行关系。现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 检测用抗原 IBV M41HI抗原、标准阳性血清和阴性血清，均购于GD公司。

1.1.2 传染性支气管炎弱毒疫苗 鸡传染性支气管炎弱毒疫苗H120，购自北京市兽医生物药品厂。

1.1.3 攻击用毒种 IBV M41株，由河南农业大学动物性食品安全重点实验室保存提供，经繁殖后测定病毒含量为每0.1 mL 10-7.5EID50。

1.1.4 试验用疫苗 分别制备鸡新城疫病毒、IBV和低致病性的禽流感病毒，按照规定的工艺浓缩、乳化制备鸡新支流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+HN6株)3批中试产品，标记为1001、1002、1003。疫苗中含灭活的鸡新城疫病毒La Sota株(灭活前的病毒含量为每0.1 mL≥3×10-8.0EID50)、IBV M41株(灭活前的病毒含量为每0.1 mL≥3×10-6.0EID50)和禽流感病毒(H9亚型)HN6株(灭活前的病毒含量为每0.1 mL≥3×10-7.0EID50)。

1.1.5 检验用鸡 180只SPF白来航鸡(70日龄)购自北京梅里亚维通实验动物有限公司，饲养在河南农业大学实验动物中心SPF鸡正负压隔离器内。

1.2 方 法

1.2.1 试验分组 参照OIE介绍的鸡传染性支气管炎灭活疫苗对产蛋鸡免疫效能的试验方法，进行如下试验。取140日龄SPF蛋鸡，第1组30只，仅接种IB H120活疫苗1羽份首免，作为弱毒疫苗基础免疫对照组；第2组90只，先接种IB H120活疫苗1羽份首免，4周后均分为3个小组，分别用3批新支流感三联灭活疫苗加强免疫(二免)，0.5 mL/只；第3组和第4组各30只，不进行任何免疫作为对照组。各组鸡都隔离饲养，记录每组鸡的产蛋量，产蛋量稳定后(二免后3周左右)，按照文献[12]的方法，对第1、2、3组试验鸡使用1∶10稀释的M41株病毒液进行点眼、滴鼻攻毒，0.3 mL/只，第4组30只未免疫试验鸡不攻毒作为空白对照组，统计攻毒后4周内产蛋的数量和质量。分别于H120活疫苗免疫前、首免后4周和攻毒试验前采集各组鸡血样，分离血清，测定抗IBV HI抗体水平。分析HI抗体水平与攻毒后产蛋性能的相关性。

1.2.2 抗IBV HI抗体水平的测定 按中国兽药典[13]中有关鸡传染性支气管炎HI抗原的使用说明测定抗呼吸型IBV 的HI抗体，具体操作如下。①取96孔V型微量反应板，每孔加25 μL PBS液。②分别吸取25 μL待检血清，加至每块板的第一列各孔内，并在每块板上设标准阳性血清和阴性血清对照，然后2倍系列稀释。③分别向各孔中加入含4 单位的抗原25 μL，2～8 ℃静置30 min。④每孔中加入体积分数1%的鸡红细胞悬液25 μL，轻轻混匀，2～8 ℃静置40 min。⑤结果判定。将反应板倾斜，凡血清反应孔与鸡红细胞对照孔中红细胞以同样速度从孔底流淌者判为血凝抑制。当阴性血清HI效价≤2-3、阳性血清HI效价与规定效价相比误差≤2-1时，则试验成立。以完全抑制4单位抗原的血清最高稀释度作为HI效价。

2 结果与分析

2.1 免疫前后产蛋鸡抗IBV HI抗体的变化

由表1可知，免疫前各组试验鸡抗体水平在2-1.0～2-2.0；首免4周后，1、2组试验鸡抗体水平为2-2.0～2-2.9；对第2组的3个小组进行二免，攻毒前其抗IBV HI抗体水平达2-8.2～2-9.3，是首免抗体水平的4.1～4.3倍，而此时第1组蛋鸡的抗体仅为2-4.8；第3、4组试验鸡未作任何免疫，在整个采血期内抗体变化不显著，抗IBV HI抗体水平均<2-3.0。

注：1组不进行二免；3组和4组不进行免疫，4组不攻毒。

Note:Chickens in group 1 had no the second vaccination;Chickens in group 3 and group 4 had no vaccination,chickens in group 4 had no challenge.

2.2 产蛋鸡抗IBV HI抗体水平与产蛋性能的关系

产蛋高峰前，监测每只鸡的产蛋量，新支流感(H9亚型)三联灭活疫苗免疫4周后(即28周龄时)，产蛋量达到高峰，产蛋率稳定维持在80%以上，此时对试验鸡采血测定二免抗体，即攻毒前抗体，采血后对试验鸡进行攻毒，统计攻毒后4周内各组试验鸡的产蛋数量和质量，结果见表1。由表1可见，对第1组：只用H120弱毒活疫苗进行免疫，攻毒前抗体水平为2-4.8，产蛋率为80.4%，产蛋质量正常。攻毒后4周内，产蛋率下降至70.2%，较攻毒前下降了12.69%，并且所产蛋的品质也有所下降，蛋壳颜色变浅，有少量畸形蛋，约占3%。

对第2组：各灭活疫菌小组攻毒前的抗体水平分别为2-8.6，2-9.3和2-8.2，产蛋率分别为80.3%，80.6%和80.5%，所产蛋质量正常。攻毒后4周内，产蛋率分别为79.1%，79.3%和79.0%，较攻毒前分别下降了1.49%，1.61%和1.86%，所产蛋的品质正常，无畸形蛋和软壳蛋，产蛋率的下降主要发生在攻毒后产蛋率统计周期的第1周，随后受试鸡产蛋率就恢复到了正常水平，这种产蛋率的下降可能是由于攻毒时引起的应激造成的。

对第3组：试验鸡未进行任何免疫，攻毒前抗体水平为2-2.0，产蛋率为80.5%，产蛋质量正常。攻毒后产蛋率下降为44.1%，较攻毒前下降了45.22%，并且产蛋的品质下降，蛋壳颜色变浅，有畸形蛋和软壳蛋，占5%～8%。

对第4组：试验鸡未进行任何免疫，不攻毒作为空白对照组，整个试验周期内，产蛋率为80.3%～80.4%，无明显波动，所产蛋的品质正常。

3 讨 论

3.1 弱毒疫苗和灭活疫苗联合免疫提高鸡抗IBV的HI抗体水平

本研究中，免疫前，各组鸡的抗IBV的HI抗体水平均≤2-2.0；使用H120活疫苗免疫后4周，HI抗体水平上升至2-2.0～2-2.9；H120活疫苗免疫后再用新支流感三联灭活疫苗加强免疫，4周后抗体水平达到2-8.2～2-9.3，而此时单独免疫H120活疫苗的HI抗体水平仅为2-4.8，而未免疫组的HI抗体水平仍<2-3.0。从试验结果来看，仅使用IB弱毒活疫苗进行免疫，并不能使试验鸡产生较高的HI抗体水平，这可能与活疫苗主要引起机体的细胞免疫反应有关[14-15]；而在活疫苗进行基础免疫的情况下，再使用灭活疫苗加强免疫，能够刺激机体产生较强的免疫应答，HI抗体水平显著升高，由此可见，使用弱毒疫苗和灭活疫苗进行联合免疫能显著提升鸡抗IBV 的HI抗体水平。

3.2 鸡抗IBV HI抗体水平与产蛋性能的关系

为研究SPF鸡血清抗体与攻毒后对产蛋性能保护的对应关系，当试验鸡产蛋量稳定在80%以上时，采血测定抗IBV HI抗体，并进行攻毒，统计攻毒后4周内各组鸡产蛋情况，结果表明，非免疫对照组抗体<2-3.0，攻毒后的产蛋率较攻毒前下降了45.22%，蛋品质也下降；免疫活苗后接种灭活苗的试验组抗体水平均在2-6.0以上，且二免抗体是首免抗体的4倍以上，攻毒后的产蛋量与攻毒前相比基本没有下降，与空白对照组的产蛋量基本一致，均维持在79%以上，并且蛋品质正常；仅进行弱毒活苗基础免疫的试验鸡攻毒前HI抗体水平为2-4.8，攻毒后产蛋率下降了12.69%，下降幅度介于以上两组之间，且蛋品质有部分下降。由此可见，鸡只的HI抗体水平与攻毒后对产蛋性能的保护力呈密切正相关，抗体水平越高，对鸡只的保护力也就越强。当HI抗体水平≥2-6.0时，攻毒后可保护产蛋鸡的产蛋量较稳定，当抗体水平<2-6.0时，对产蛋鸡的保护力相对较低，抗体水平越低，攻毒后鸡只的产蛋量下降也较多。据英国药典[16]规定，合格疫苗的标准应该是，能够刺激机体产生≥2-6.0的抗体，而在OIE中对用于产蛋鸡免疫疫苗的效力评价同样规定,免疫SPF鸡4周后平均HI效价>2-6.0。本研究结果与上述标准一致。

3.3 用HI抗体水平检测开产鸡的免疫力

根据OIE规定，在进行含有IBV灭活疫苗免疫效能检验(对产蛋鸡)时，可进行如下分组：弱毒苗基础免疫试验组、弱毒苗基础免疫和三联灭活疫苗联合免疫试验组和不进行任何免疫对照组。本研究在试验分组时，又增加了空白不攻毒对照组，同时将灭活疫苗加强免疫的时间设在了产蛋高峰前4周，当免疫后4周采血时产蛋率已达高峰，所检测的抗体水平即可作为攻毒前抗体水平，避免了多次采血对试验鸡的应激影响。OIE规定对照组攻毒后产蛋率下降至少67%，而目前国际上对攻毒试验的判定标准有放宽的趋势，如欧洲药典[17]规定，用麻省型的毒株对非免疫鸡群攻毒能引起35%以上的产蛋下降时，疫苗免疫组对产蛋的保护才认为有效。本试验中，对照组攻毒后产蛋率下降了45.22%，未达到OIE中的规定，这可能是由于攻击用M41毒株使用的量以及攻毒株繁殖代次等原因造成的毒力变化所致，也可能是随SPF鸡日龄的增加其抵抗力有所增强造成的。由于影响试验鸡产蛋率的因素较多，试验过程中必须进行标准的饲养管理，保证试验鸡处在相同的外部环境中，排除任何可能会影响到试验结果的因素。由于受试验条件的限制，对产蛋鸡的攻毒试验在以往的研究中较少，积累的经验缺乏，有待以后开展更大规模的研究验证工作。

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Relationship between HI antibody titers against infectious bronchitis virus and egg production rate

LI Xin-sheng1,JIAO Xian-qin1,GAO Wen-ming1,LI Shuang-liang2, ZHANG Xiu-wen3,CUI Bao-an1

(1CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan450002,China; 2HenanEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Zhengzhou,Henan450003,China;3ZhejiangMeibaolongBiotechnologyLtd,Jinhua,Zhejiang321017,China)

【Objective】 This paper studied the relationship between HI antibody titers against infectious bronchitis virus strain and egg production rate.【Method】 180 SPF chickens were divided into 4 groups.Chickens in the first and second groups were immunized with H120live vaccine.4 weeks later,the second group chickens were vaccinated with Newcastle disease,infectious bronchitis,and avian influenza virus (H9subtype) triple inactivated vaccine (La Sota+M41+HN6 strain).Group 3 and Group 4 had no immunization.4 weeks after vaccine was inoculated,the antibody in blood of tested chickens was determined when the egg production rate was stably over 80%.Then,the first three groups were challenged by virulent infectious bronchitis virus M41strain,and chicken laying performance and egg quality were recorded in the following 4 weeks.Then the relationship between HI antibody titers against infectious bronchitis virus strain and egg production performance was analyzed.【Result】 Chicken egg laying performance was not affected by virulent infectious bronchitis virus when their HI antibody titers against virulent infectious virus were 2-8.2-2-9.3.The first group which was only immunized by live attenuated vaccine had the HI titers of 2-4.8,and the egg production rate decreased by 12.69%.The HI tiers of control group were 2-2.0,and egg production rate decreased by 45.22%.【Conclusion】 HI antibody titers and egg production performance were positively related.HI antibody detection can be used to evaluate the immune efficacy of inactivated vaccines with infectious bronchitis virus.

IBV;HI antibody titer;challenge;egg production

2013-09-20

河南省科技创新人才计划项目(144100510009)；郑州市前沿技术研究开发项目(141PQYJS566)

李新生(1969-)，男，河南荥阳人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事分子病原学研究。 E-mail：harmony69@126.com

崔保安(1948-)，男，河南荥阳人，教授，学士，博士生导师，主要从事分子病原学研究。E-mail：baoancui@gmail.com

时间:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.029

S852.4

A

1671-9387(2015)01-0026-05

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.029.html