益气温阳活血方对慢性心力衰竭心室重塑患者外周血单个核细胞Bax/Bcl-2表达的影响*

卞震炯，杨冬花

（1.贵阳中医学院第二附属医院心内科，贵州 贵阳 550003；2.贵州省人民医院干医科，贵州 贵阳 550002）

·论著·

益气温阳活血方对慢性心力衰竭心室重塑患者外周血单个核细胞Bax/Bcl-2表达的影响*

卞震炯1，杨冬花2

（1.贵阳中医学院第二附属医院心内科，贵州 贵阳 550003；2.贵州省人民医院干医科，贵州 贵阳 550002）

目的探讨益气温阳活血方对慢性心力衰竭心室重塑患者外周血单个核细胞（PBMC）BCL-2相关X蛋白（BCL2-Associated X Protein，Bax）/B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）表达的影响。方法将慢性心力衰竭患者122例随机分为治疗组和对照组，两组均按慢性心力衰竭治疗指南给予常规治疗，治疗组加服用益气温阳活血方，治疗共3个月。两组治疗前后分别以心脏超声检查患者左心室收缩末径（LVESD）、舒张末径（LVEDD）和左心室射血分数（LVEF），逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法以及蛋白免疫印记法（Western-blot）检测Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白质表达水平。结果3个月后，与治疗前比较，对照组、治疗组治疗后LVESD、LVEDD、Bax mRNA及蛋白质表达水平降低，而LVEF、Bcl-2 mRNA及蛋白质表达水平则升高，差异均有统计学意义（P<0.05），且治疗组治疗后上述指标与对照组治疗后比较进一步改善，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论益气温阳活血方通过下调Bax基因表达以及上调Bcl-2基因表达抑制慢性心力衰竭患者心室重塑，改善心脏功能。

心室重塑；Bax；Bcl-2；益气温阳活血方；临床研究

慢性心力衰竭是大多数心血管疾病的最终归宿，也是最主要的死亡原因。近年来的研究表明，心肌细胞凋亡在心力衰竭的发生、发展及心室重塑方面起着重要作用[1]。Bax/Bcl-2为细胞凋亡相关基因，Bcl-2抑制细胞凋亡，而Bax则促进细胞凋亡，Bcl-2与Bax的比例决定细胞是否发生凋亡[2]。前期研究发现，益气温阳活血方可减少心力衰竭大鼠内皮素-1、升高一氧化氮及一氧化氮合酶的水平，阻断钙调磷酸神经激酶（calcineurin，CaN）信号通路活化抑制心室重塑[3-4]，但是否能通影响慢性心力衰竭患者PBMC Bax/Bcl-2的表达抑制心室重塑，目前尚不清楚。本研究通过观察益气温阳活血方对慢性心力衰竭心室重塑患者PBMC Bax/Bcl-2表达的影响，为进一步临床运用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

2012年12月-2014年12月贵阳中医学院第二附属医院心血管内科住院及门诊慢性心力衰竭患者122例，心功能II～IV级（依照纽约心脏病协会分级），所有病例诊断均参照2007年《中国慢性心力衰竭诊断治疗指南标准》，按随机分组原则分为慢性心力衰竭常规治疗组（对照组）和慢性心力衰竭常规治疗加益气温阳活血方组（治疗组）。治疗组64例。其中，男34例，女30例；年龄53～84岁（66±10）岁；心功能II级22例，III级26例，IV级16例；冠心病28例，高血压性心脏病18例，糖尿病性心肌病12，扩张型心肌6例。对照组58例。其中，男31例，女27例；年龄54～83岁（65±11）岁；心功能II级20例，III级24例，IV级14例；冠心病26例，高血压性心脏病17例，糖尿病性心肌病10，扩张型心肌5例。两组患者性别、年龄、体重指数、血压、血脂、血糖及肝肾功能等一般资料比较差异无统计学意义（P> 0.05）。排除先天性心瓣膜病、风湿性心瓣膜病、甲亢性心脏病、结核性心包积液、慢性阻塞性肺疾病、非脂肪肝性肝功能不良、严重肾功能不全、近期1个月内有重大创伤、手术、感染、肿瘤及血液疾病患者。所有入选者均征得同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

淋巴细胞分离液（中国医学科学院血液学研究所），Trizol（Invitroge公司），Rnasin（Promega公司），M-MLV（Promega公司），引物由上海生物工程公司合成，Bax和Bcl-2一抗抗体（Santa Cruz公司），ECL显影试剂盒（Santa Cruz公司），制胶、电泳及转膜仪（Bio-Rad公司），PCR仪（Eppendorf公司），酶标仪（Bio-Rad公司），超声心动图诊断仪2500型（美国惠普公司）。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法两组均按慢性心力衰竭治疗指南给予常规治疗，包括利尿剂、血管紧张素酶抑制剂、β受体阻滞剂及洋地黄等。治疗组在常规治疗基础上，加用益气温阳活血方，处方：人参30 g，黄芪30 g，桂枝9 g，丹参30 g，益母草30 g，红花6 g，白术15 g，泽泻9 g，茯苓15 g，葶苈子9 g，炙甘草6 g。每天1剂，水煎，头煎加水500 ml，取汁150 ml，2煎加水400 ml，取汁100 ml，2煎混匀，分3次口服。两组共用药3个月。

1.3.2 心脏结构及心功能测定两组受试对象治疗前和治疗结束后采用惠普2500超声心动图诊断仪，探头频率3.2 MHz，指定具有丰富经验的专业技术人员操作，测定左心室收缩末径（Left ventricular end systolic diameter，LVESD）、舒张末径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）和左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF），连续3次，取其平均值。

1.3.3 PBMC的分离取两组受试对象治疗前和治疗结束后外周血4 ml，肝素抗凝，按淋巴细胞分离液常规Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。

1.3.4 Bax、Bcl-2 mRNA的表达Bax（500 bp）正向：5'-CCCACCAGCTCTGAACAGTTC-3'，反向：5'-C CAGCCACAAAGATGGTCAC-3'；Bcl-2（369 bp）正向5'-CTTCGCCGAGATGTCCAG-3'，反向5'-GGCTCA GATAGGCACCCA-3'；GAPDH（300 bp）正向5'-CAT CTCTTGCTCGAAGTCCA-3'，反向：5'-ATCATGTTTG AGACCTTCAACA-3'。按Trizol试剂说明书提取PBMC总RNA，参照第一链cDNA合成试剂盒说明书进行逆转录反应，然后进行PCR反应。取PCR产物5μl进行琼脂糖凝胶电泳、照相，利用UVP凝胶扫描仪测定条带的吸光度（A）值，以目的基因与GAPDH条带的吸光度（A）值的比值代表其表达的相对量。

1.3.5 Bax、Bcl-2蛋白质的表达提取PBMC蛋白质，制备聚丙烯酰胺凝胶、蛋白电泳、转膜。一抗浓度均为1∶1 000，二抗浓度为1∶2 000，化学发光试剂法曝光、显影和定影，凝胶成像分析系统进行密度扫描并分析。

1.4 统计学方法

结果为计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 19.0软件分析处理，两组治疗后比较采用t检验，同组治疗前后比较采用配对t检验，P< 0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前后心脏结构、功能的比较

与治疗前组内比较，对照组和治疗组治疗后LVESD、LVEDD缩小，LVEF则均提高，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组治疗后比较，治疗组治疗后LVESD、LVEDD缩小，LVEF则提高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

2.2 两组治疗前后Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白质表达水平检测

与治疗前组内比较，对照组和治疗组治疗后Bax mRNA及蛋白质表达水平均降低，而Bcl-2 mRNA及蛋白质表达水平则均升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组治疗后比较，治疗组治疗后Bax mRNA及蛋白质表达水平降低，而Bcl-2 mRNA及蛋白质表达水平则升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。

Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白质表达的琼脂糖电泳图和聚丙烯酰胺凝胶蛋白质电泳图，见图1～4。

表1 两组治疗前后心脏结构、功能的比较（s）

表1 两组治疗前后心脏结构、功能的比较（s）

注：1）与治疗前组内比较，P<0.05；2）与对照组治疗后比较，P< 0.05

组别nLVEDD/mmLVESD/mmLVEF/%对照组治疗前5859.69±2.7833.38±3.5144.17±4.03治疗后治疗组5857.62±3.081）30.54±2.851）47.00±3.771）治疗前6460.04±3.0234.01±3.2143.37±4.32治疗后6456.49±2.321）2）29.12±2.061）2）48.41±3.441）2）

表2 两组治疗前后Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白质表达水平检测（±s）

表2 两组治疗前后Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白质表达水平检测（±s）

注：1）与治疗前组内比较，P<0.05；2）与对照组治疗后比较，P< 0.05

组别nBax mRNA（相对量）Bcl-2 mRNA（相对量）Bax蛋白质（相对量）Bcl-2蛋白质（相对量）对照组治疗前580.79±0.080.65±0.105.05±1.143.02±1.03治疗后治疗组58 0.63±0.101）0.74±0.111）3.11±1.061）4.62±1.061）治疗前640.79±0.090.66±0.104.93±1.272.99±0.98治疗后64 0.60±0.101）2）0.78±0.101）2）2.77±0.731）2）5.03±1.121）2）

图1 Bax mRNA的表达

图2 Bax蛋白质的表达

图3 Bcl-2 mRNA的表达

图4 Bcl-2蛋白质的表达

3 讨论

细胞凋亡是细胞在自身基因调控下进行的一种主动死亡过程，故又称程序性细胞死亡[5]。近年研究表明，心力衰竭时左室功能的不断恶化是心肌细胞反复丢失和（或）剩余心肌细胞收缩功能逐渐退化的结果，而心肌细胞死亡是心肌细胞不断丢失的根源所在，心肌细胞死亡使心肌细胞大量丢失导致心室重塑和心力衰竭[6]。

Bcl-2家族是与细胞凋亡紧密相关的基因家族，该家族的蛋白产物从功能上分为两类：一类具有抑制凋亡作用，如Bcl-2基因，另一类则具有促进凋亡作用，如Bax基因[7]。Bcl-2是从滤泡B细胞瘤中克隆出的第一个抑制凋亡的蛋白，主要位于线粒体膜、滑面内质网及核膜上，可抑制多种原因引起的细胞程序性死亡[8]；Bax是Bcl-2家族中的促凋亡成员，是一个可溶性蛋白分子，主要位于细胞质中，当凋亡信号发生时，Bax从胞质中转移到线粒体，并与线粒体膜相结合，发挥促凋亡作用，两者蛋白水平的高低与凋亡调控直接相关[9]。有研究发现，心力衰竭心肌中Bcl-2蛋白表达下降92%，Bax蛋白表达增强52%，Bcl-2与Bax蛋白的比例下降[10]。

近年来研究发现，中医药在延缓心力衰竭、改善患者临床症状、对抗心力衰竭西药的不良反应上显示了其独特疗效，并具有一定的优势。比如中医药在干预病理性心肌凋亡、细胞肥大和心肌纤维化等方面疗效肯定，同时中医药协同西药，既可消除或减少血管紧张素转化酶抑制剂和β受体阻滞剂的不良反应，又缩短了药物剂量递增的时间[11]。本实验也发现，益气温阳活血方对慢性型力衰竭心室重塑患者凋亡相关蛋白的表达以及心脏结构和功能得到明显改善，具体表现为促凋亡蛋白Bax的表达下调，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达上调，心脏射血分数增加，左室舒张末期內径及左室收缩末期內径下降。有研究发现，CaN通过影响Bad的磷酸化，拮抗Bcl-2家族抗凋亡作用[12]，或活化转录因子活化T细胞核因子3，使其由胞质转位于胞核，介导凋亡相关基因的表达诱导心肌细胞凋亡[13]。前期研究也发现，益气温阳活血方可阻断CaN信号通路活化抑制心室重塑[3]。故推测，益气温阳活血方通过阻断CaN信号通路活化，调节凋亡基因Bax、Bcl-2的表达，改善慢性心力衰竭患者心脏功能、抑制心室重塑。具体机制有待于进一步研究。

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Effects of Yiqiwenyanghuoxue decoction on Bax/Bcl-2 of PBMC in chronic heart failure patiens with cardiac remodeling

Zhen-jiong BIAN1,Dong-hua YANG2
(1.Department of Cardiology,the Second Affiliated Hospital of Guiyang Traditional Chinese Medicine College,Guiyang,Guizhou 550003,P.R.China;2.Cardre Ward,Guizhou People's Hospital,Guiyang,Guizhou 550002,P.R.China)

【Objective】To study the effects Yiqiwenyanghuoxue decoction on Bax/Bcl-2 of PBMC in the cardiac remodeling of patients with chronic heart failure.【Methods】122 patients with chronic heart failure were randomly divided into control group and treated group.The control group were given conventional treatment,the treated group were given Yiqiwenyanghuoxue decoction and combined routine therapy,three months was taken as a course of treatment.LVESD,LVEDD and LVEF were measured by ultrasonic cradiography,mRNA and protein levels of Bax and Bcl-2 were evaluated with RT-PCR and Western-blot respectively.【Results】After 3 months,LVEDD, LVESD,mRNA and protein levels of Bax were decreased while LVEF,mRNA and protein levels of Bcl-2 were increased in both therapy group compared with those pre-therapy(P＜0.05,respectively),and the above indicators got further improvement in treated group compared with control group(P<0.05,respectively).【Conclusion】Yiqiwenyanghuoxue decoction could inhibit the myocardial remodeling through down-regulating Bax and upregulating Bcl-2.

cardiac remodeling;Bax;Bcl-2;decoction of Yiqiwenyanghuoxue;clinical research

1005-8982（2015）34-0006-04

R286

A

2015-04-13

贵州省科技联合基金项目（黔科合中药字[2012]LKZ7009号）