褪黑素联合顺铂、甲氨蝶呤对骨肉瘤SaOS- 2细胞增殖的影响

王亚鹏，杨志平

山东大学　齐鲁医院骨科，济南 250012



褪黑素联合顺铂、甲氨蝶呤对骨肉瘤SaOS- 2细胞增殖的影响

王亚鹏，杨志平

山东大学齐鲁医院骨科，济南 250012

摘要：目的探讨褪黑素(Mel)联合顺铂(DDP)、甲氨蝶呤(MTX)对骨肉瘤细胞系SaOS- 2增殖的影响，以及Mel与DDP、MTX是否具有协同抗肿瘤作用。方法Mel、DDP、MTX、Mel+DDP、Mel+MTX作用于SaOS- 2细胞后，CCK- 8法检测药物对细胞活性的影响，应用Compusyn软件分析药物的合并效应,流式细胞术分析细胞周期分布及细胞凋亡率。结果与对照组相比，Mel、DDP、MTX单独均能显著降低SaOS- 2细胞活性(P均<0.05)，且呈剂量-效应关系。与单用DDP或MTX相比，Mel与DDP或MTX联合应用能显著降低SaOS- 2细胞的活性(P均<0.05)。1 mmol/L的Mel与6.67、16.67、33.33、66.66 μmol/L 的DDP合用时，联合用药指数(CI)分别为1.18、1.21、1.09、0.84，与0.1、0.5、1、2、4 mmol/L MTX合用后，CI分别为0.88、0.88、0.83、0.78、0.81。与对照组相比，Mel组与Mel+MTX组的G1期细胞比例显著增多(P均<0.05)，S期细胞比例显著减少(P均<0.05)；MTX组的S期细胞比例显著增多(P均<0.05)。药物作用组的细胞凋亡率均显著高于对照组(P均<0.05)，联合用药组的细胞凋亡率显著高于单药组(P均<0.05)。结论Mel在体外能抑制SaOS- 2细胞的活性，阻滞细胞周期于G1期，诱导凋亡，发挥抗肿瘤效应，与较低浓度DDP呈拮抗效应，而与MTX、较高浓度DDP联合应用时呈协同抗肿瘤效应。

关键词：骨肉瘤；褪黑素；顺铂；甲氨蝶呤

ActaAcadMedSin，2015,37(2)：215-220

骨肉瘤是好发于青少年的骨原发性恶性肿瘤。以顺铂(cis-platinum，DDP)、大剂量甲氨蝶呤为主的新辅助化疗能提高骨肉瘤患者的生存率，但是化疗药物的毒副作用、化疗耐药以及患者的化疗依从性限制了骨肉瘤的治疗效果。研究证实，作为一种肿瘤化疗的辅助用药，褪黑素(melatonin，Mel)不仅能减少骨肉瘤化疗的副作用[1- 2]，还能降低肿瘤化疗的耐药发生率[1- 3]，提高患者化疗依从性[4- 6]。Mel不仅能直接杀伤骨肉瘤细胞，而且使细胞周期阻滞于G1期[7]，诱导细胞凋亡。DDP属于重金属盐类，是非特异性细胞周期药物，DDP分子中的Pt与DNA络合后，诱导细胞凋亡。二氢叶酸还原酶抑制剂甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)能阻滞细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，理论上Mel与DDP和MTX联用时应该具有协同抗肿瘤作用。本研究将Mel、DDP、MTX单独或联合作用于骨肉瘤SaOS- 2细胞，比较细胞活性、细胞周期分布和凋亡率的变化，并采用Compusyn软件分析药物的合并效应，旨在研究Mel与DDP、MTX是否具有协同抗肿瘤作用，为Mel作为骨肉瘤化疗的辅助用药提供依据。

材料和方法

细胞培养及传代人成骨肉瘤细胞株SaOS- 2购自中国科学院上海细胞库。细胞培养于含10%胎牛血清(Hyclone公司，USA)的McCOY’s 5A培养基(Gibco公司，美国)，置于湿度饱和、含5% CO2、37 ℃培养箱中培养，贴壁生长，每周传代2次，按1∶2或1∶3传代。

CCK- 8检测细胞增殖将细胞按2×103/孔密度接种于96孔板，待细胞贴壁后更换含药物的培养基。Mel购自大连美仑生物技术公司，溶解于无水乙醇，终浓度<1%；DDP购自山东省齐鲁制药有限公司，溶解于0.9% NaCl溶液，使用时用培养基至少稀释100倍；MTX购自江苏恒瑞制药股份有限公司，溶解于0.9% NaCl溶液，使用时用培养基至少稀释12.5倍。

分组如下：(1)以培养基为对照组，以Mel(0.5、1、2、4、5 mmol/L)、DDP(3.33、6.67、16.67、33.33、66.66 μmol/L)、MTX(0.1、0.5、1、2、4 mmol/L)为实验组，每组设3个复孔，药物分别作用24、48 h后，加入CCK- 8，避光孵育4 h，上机检测490 nm波长的光密度(optical density，OD)值。CCK- 8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自上海贝博公司。(2)以培养基为对照组，以Mel(1 mmol/L)+DDP(3.33、6.67、16.67、33.33、66.66 μmol/L)、Mel(1 mmol/L)+MTX(0.1、0.5、1、2、4 mmol/L)为实验组，每组设3个复孔，孵育细胞48 h后检测OD值。计算细胞活性(%)=(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%。采用Compusyn软件分析合并用药效应，联合用药指数(combination index，CI)<1为协同效应，CI=1为相加效应，CI>1为拮抗效应[8]。

细胞周期和凋亡测定以培养基为对照组，以Mel(1 mmol/L)、DDP(16.67 μmol/L)、MTX(0.5 mmol/L)，Mel(1 mmol/L)+DDP(16.67 μmol/L)、Mel(1 mmol/L)+MTX(0.5 mmol/L)为实验组，每组3个复孔。取对数生长期的细胞消化离心后，制备细胞悬液，以3×106/孔接种于6孔板，过夜后弃培养基，加入含药物的培养基，培养48 h后收集细胞，按试剂盒说明书检测细胞周期和凋亡。碘化丙锭单染法检测细胞周期分布；Annexin V-FITC和碘化丙锭双染法检测细胞凋亡，细胞凋亡率=(FITC标记细胞数/总细胞数)×100%。细胞周期检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒均购自上海贝博公司。

统计学处理采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示，采用方差分析进行组间均数比较。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

药物对细胞活性的影响对照组的细胞活性为100%。与对照组相比，Mel显著降低SaOS- 2细胞活性(P均<0.01)；当Mel的浓度大于2 mmol/L时，Mel作用48 h的SaOS- 2细胞活性显著低于Mel作用24 h的细胞(P均<0.01)(图1A)。

与对照组比较，3.33 μmol/L的DDP作用48 h后，细胞活性无改变(P>0.05)，其他浓度的DDP单独作用或与1 mmol/L Mel联合使用均能显著降低SaOS- 2细胞活性(P均<0.01)。1 mmol/L的Mel与6.67、16.67、33.33、66.66 μmol/L 的DDP合并用药时，CI分别为1.18、1.21、1.09、0.84，表明Mel与较低浓度DDP呈拮抗效应，与较高浓度的DDP(66.66 μmol/L)时呈协同效应(图1B)。

MTX作用于SaOS- 2细胞48 h后，细胞活性显著降低(P均<0.05)。Mel与MTX联合应用能显著降低SaOS- 2细胞的活性(P均<0.05)。1 mmol/L Mel与0.1、0.5、1、2、4 mmol/L MTX联合用药后，CI分别为0.88、0.88、0.83、0.78、0.81，表明Mel能促进MTX的抗肿瘤效应(图1C)。

药物对细胞周期分布和细胞凋亡的影响与对照组比较，Mel组与Mel+MTX组的G1期细胞比例显著增多(P均<0.05)，S期细胞比例减少(P均<0.05)；MTX组的S期细胞比例增多(P均<0.05)。DDP组和Mel+DDP组的G1期和S期细胞比例与对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)；各实验组的G2期细胞比例与对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。即Mel能够阻滞细胞于G1期，MTX能阻滞细胞于S期，而DDP对细胞周期无影响(图2)。

Mel、DDP、MTX、Mel+DDP、Mel+MTX孵育骨肉瘤SaOS- 2细胞48 h后，细胞凋亡率分别为(16.38±0.21)%、(18.54±1.16)%、(17.77±1.36)%、(39.49±1.75)%、(37.77±2.64)%(图3)。与对照组(3.97±0.02)%相比，各实验组的细胞凋亡率显著提高(P均<0.05)。Mel+DDP、Mel+MTX组分别与对应单药组Mel、DDP、MTX比较，细胞凋亡率显著提高(P均<0.05)。

Mel：褪黑素；DDP：顺铂；MTX：甲氨蝶呤；对照组的细胞活性为100%；与对照组比较，aP<0.01；与药物作用24 h组比较，bP<0.01；与DDP组比较，cP<0.05；与MTX组比较，dP<0.05

Mel：melatonin；DDP：cis-platinum；MTX：methotrexate；the cell activities of SaOS- 2 in the control group were 100%；aP<0.01 compared with the control group；bP<0.01 compared with the cell activities of SaOS- 2 treated by Mel for 24 hours；cP<0.05 compared with the DDP group；dP<0.05 compared with the MTX group

A.Mel分别作用SaOS- 2细胞24、48 h的细胞活性；B.DDP处理SaOS- 2细胞48 h后的细胞活性；C.MTX处理SaOS- 2细胞48 h后的细胞活性

A.the cell activities of SaOS- 2 treated by Mel for 24 and 48 hours，respectively；B.the cell activities of SaOS- 2 treated by DDP for 48 hours；C.the cell activities of SaOS- 2 treated by MTX for 48 hours

图 1药物作用后SaOS- 2细胞活性的比较

Fig 1Comparisons of cell activities of SaOS- 2 treated with drugs

图 2药物作用 48 h后SaOS- 2细胞周期分布

Fig 2Cell cycle distribution of SaOS- 2 cells treated by the three drugs alone or in combination for 48 hours

PI：碘化丙锭；Annexin V-FITC：；磷脂酰丝氨酸蛋白抗体-异硫氰酸荧光素

PI：propidium iodide；Annexin V-FITC：Annexin V-fluorescein isothiocyanat

图 3流式细胞术检测药物作用 48 h对SaOS- 2细胞凋亡的影响

Fig 3Apoptosis of SaOS- 2 cells treated by the three drugs alone or in combination for 48 hours

讨论

有研究表明Mel能诱导多种肿瘤细胞凋亡[9- 14]。另有研究显示,骨肉瘤组织中Mel受体MT1的表达明显提高，且与肿瘤细胞是否转移成正相关[15]。研究显示低于0.01 mmol/L浓度的Mel对骨肉瘤细胞系MG- 63的增殖无影响[16]，0.25～1 mmol/L的Mel能不同程度地抑制骨肉瘤细胞增殖[17]。Liu等[7]的研究进一步验证了Mel对骨肉瘤MG- 63细胞增殖的影响呈剂量—效应关系。本研究显示，0.5、1、2、4、5 mmol/L浓度的Mel作用SaOS- 2细胞24、48 h后，细胞的增殖均受到抑制，且呈时间—剂量—效应关系。

Casado-Zapico等[18]研究显示高浓度Mel主要通过抑制细胞增殖和细胞毒性效应发挥抗肿瘤作用，抑制细胞增殖的可能机制是调节细胞周期，细胞毒性效应的可能机制是启动外源性或内源性细胞凋亡通路。本研究显示SaOS- 2细胞在与Mel共孵育48 h后，G1期细胞的比例显著增多，S期细胞的比例显著减少，细胞凋亡率显著增加。提示Mel可能通过下调与G1/S期细胞相关的周期蛋白细胞周期素D1和细胞周期素依赖激酶 4[7]，阻滞细胞于G1期；同时上调P53、细胞色素C等外源性凋亡通路相关蛋白，下调Bcl2等[19]，诱导细胞凋亡。

Mel还与许多化疗药物具有协同抗肿瘤作用。Mel通过去磷酸化串联灭活ERK/p90RSK/HSP27途径，增强DDP对卵巢癌SK-OV- 3细胞系的凋亡作用[17]。Mel通过上调Caspase- 3、Caspase- 8、Caspase- 9表达，激活外源性细胞凋亡途径，增强长春新碱、异环磷酰胺对尤文肉瘤SK-N-MC细胞的杀伤作用[18]。本研究1 mmol/L的Mel分别与6.67、16.67、33.33的DDP联合应用时，SaOS- 2细胞的活性显著低于DDP单独作用的细胞(P均<0.05)，然而二者的抗肿瘤作用呈拮抗效应(CI>1)，这可能与Mel[20]清除了DDP产生的一部分自由基[21]，削弱了DDP对肿瘤细胞的杀伤作用有关。Mel与66.66 μmol/L 的DDP联合用药时，二者呈现协同抗肿瘤效应，提示联合应用Mel与DDP时要考虑二者的浓度关系。由于DDP对细胞周期无明显调节作用，主要通过启动外源性或内源性凋亡途径直接发挥肿瘤细胞杀伤作用[22]，因此，Mel与DDP联合用药组的细胞周期分布与对照组差异无统计学意义，而细胞凋亡率较对照组显著增高。本研究显示Mel与MTX联用组SaOS- 2细胞的活性较MTX单药作用细胞显著下降(P<0.05)，细胞凋亡率显著提高(P<0.05)，二者具有协同抗肿瘤效应(CI<1)，这可能与Mel阻滞细胞于G1期，MTX阻滞细胞于S期，二者的细胞周期阻滞作用相互叠加，同时Mel发挥细胞毒性效应杀伤肿瘤细胞有关。

综上，Mel在体外能抑制SaOS- 2细胞的活性，阻滞细胞周期于G1期，诱导凋亡，发挥抗肿瘤效应，与较低浓度DDP呈拮抗效应，而与MTX、较高浓度DDP联合应用时呈协同抗肿瘤效应。

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DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.02.013

Effects of Melatonin Combined with Cis-platinum or Methotrexate on the Proliferation of Osteosarcoma Cell Line SaOS- 2

WANG Ya-peng，YANG Zhi-ping

Department of Osteology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China

Corresponding author：YANG Zhi-pingTel：13505412856，E-mail：yzpyzp@163.com

ABSTRACT：ObjectiveTo evaluate the effects of melatonin(Mel)combined with cis-platinum(DDP)or methotrexate(MTX)on the proliferation of osteosarcoma cell line SaOS- 2，and to explore whether Mel combined with DDP or MTX could play a synergistic antitumor effect.MethodsSaOS- 2 was treated with Mel alone or Mel combined with DDP or MTX.Cell counting kit- 8 assay was used to measure the cell activities.Combination index(CI)value was used to evaluate the combined effects：CI<1 indicating synergetic effect，CI=1 additive，and CI>1 antagonistic.Flow cytometry was used to analyze cell cycle distribution and cell apoptosis.ResultsAfter treated with Mel(0.5，1，2，4，5 mmol/L)，DDP(6.67，16.67，33.33，66.66 μmol/L)or MTX(0.1，0.5，1，2，4 mmol/L)alone，SaOS- 2 cell activities decreased in a dose-dependent manner(allP<0.05).The activities of SaOS- 2 cell treated with both Mel(1 mmol/L)and DDP or MTX were significantly lower than that of DDP or MTX alone(allP<0.05).CI values of cells exposed to 1 mmol/L Mel plus 6.67，16.67，33.33，and 66.66 μmol/L DDP were 1.18，1.21，1.09，and 0.84，respectively，and CI values of cells exposed to 1 mmol/L Mel plus 0.1，0.5，1，2，and 4 mmol/L MTX were 0.88，0.88，0.83，0.78，and 0.81，respectively.The G1-stage cells were increased and the S-stage cells were reduced when the cells were treated with Mel(1 mmol/L)alone or combined with MTX(0.5 mmol/L)(P<0.05).The S-stage cells were increased when the cells treated with MTX(0.5 mmol/L)(P<0.05).The apoptotic cells were increased when they treated with Mel(1 mmol/L)alone or combined with DDP(16.67 μmol/L)or MTX(0.5 mmol/L)(P<0.05).When the cells were treated with Mel combined with DDP or MTX，the apoptotic cells were more than that of DDP or Mel alone(P<0.05).ConclusionsMel can inhibit SaOS- 2 cells activity，block the cell cycle at G1-stage，and induce apoptosis.Mel has an antagonistic effect with lower concentration of DDP but a synergistic effect with MTX or higher concentration of DDP.

Key words：osteosarcoma；melatonin；cis-platinum；methotrexate

(收稿日期：2014- 09- 12)

中图分类号:R738.1

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2015)02- 0215- 06

通信作者：杨志平电话：13505412856，电子邮件：yzpyzp@163.com