声辐射力脉冲弹性成像技术与二维剪切波弹性成像技术在评估兔肝脏纤维化等级中的作用

李　楠，罗渝昆，唐文博

中国人民解放军总医院超声诊断科，北京 100853



声辐射力脉冲弹性成像技术与二维剪切波弹性成像技术在评估兔肝脏纤维化等级中的作用

李楠，罗渝昆，唐文博

中国人民解放军总医院超声诊断科，北京 100853

摘要：目的探讨声辐射力脉冲成像技术(ARFI)及二维剪切波弹性成像技术(2D-SWE)在诊断肝脏纤维化等级(LF)方面的差异。方法新西兰大白兔60只，随机分为对照组(10只，无处理)和LF组(50只，注射四氯化碳以建立不同程度的LF模型)。利用ARFI及2D-SWE对所有动物进行肝脏硬度(LS)的测定，并取相同部位肝脏组织进行病理学分析，根据Spearman等级相关分析LF及LS之间相关性，通过构建受试者工作特性曲线比较两种技术在诊断效能方面的差异。结果共成功取得37只动物的实验数据，其中F0级14处、F1级11处、F2级15处、F3级12处、F4级22处。所有动物均成功进行LS的测定，LF与ARFI测定结果之间呈线性相关(r=0.802，P<0.01)，与2D-SWE测定结果呈线性相关(r=0.892，P<0.01)。成功构建受试者工作特性曲线，ARFI诊断LF>F0、F1、F2、F3的曲线下面积分别为0.809、0.916、0.938、0.934；2D-SWE诊断LF>F0、F1、F2、F3的曲线下面积分别为0.917、0.935、0.976、0.974。结论ARFI及2D-SWE技术均能较为准确地反应LF的等级，且2D-SWE技术的诊断效能优于ARFI技术。

关键词：声辐射力脉冲成像技术；二维剪切波弹性成像技术；肝脏纤维化；肝脏硬度

ActaAcadMedSin，2015,37(2)：157-162

慢性肝病是危害人类健康的常见疾病[1]，在全球范围内均具有较高的发病率和死亡率。作为各种慢性肝病的共同病理变化，肝脏纤维化(liver fibrosis，LF)在反映疾病严重程度和预后情况方面具有重要意义[2]。有研究证实声辐射力脉冲成像技术(acoustic radiation force impulse，ARFI)在评估LF等级方面具有较高的意义[3- 4]，然而，由于不能实时显示弹性测定结果、取样框不可调及缺乏质控指标等缺点，其临床应用仍然受到一定限制。二维剪切波弹性成像技术(two-dimensional shearwave elastography，2D-SWE)的出现为避免上述问题提供了解决方案，该技术自首次应用于肝脏以来，已受到研究者们广泛认可，有学者认为其是判断LF最佳的弹性成像方式[5]。本研究通过建立肝纤维化动物模型，同时进行ARFI检查和2D-SWE检查，比较两种技术在评估LF等级中的价值和优缺点。

材料和方法

实验动物及药品中国人民解放军总医院实验动物中心新西兰大白兔60只，体重2.0～2.5 kg，雌雄各半。所有动物每日喂食2次，每次100～150 g，每日保持12 h明暗环境，室温控制在15～21℃。麻醉剂采用3%戊巴比妥钠(剂量为30 mg/kg)，由国药集团化学试剂有限公司提供；四氯化碳由国药集团化学试剂有限公司提供；食用玉米油由中粮集团有限公司提供。实验所需注射用生理盐水由北京双鹤药业股份有限公司提供。

模型建立将动物随机编号，分为对照组(10只)和实验组(50只)。实验组动物每周向腹腔内注射四氯化碳玉米油溶液两次(体积比为1∶4，0.5 ml/kg)。建模第3周开始实验，于每个四氯化碳注射日进行1只实验组动物的实验，每4个四氯化碳注射日进行1只对照组动物的实验。

实验操作及病理标本取材所有实验动物术前空腹1 d，以3%戊巴比妥钠肌内注射麻醉，麻醉成功后

将动物肝区褪毛，经腹正中切口，充分暴露肝脏后行弹性超声测定。每只动物均对其中两个不同的肝叶行肝脏硬度(liver stiffness，LS)的测定，测定时进行必要的固定以减小呼吸动度的影响。实验操作完成后，即刻取所测部位肝组织浸泡于10%福尔马林中，HE染色，10×10倍及10×40倍显微镜下观察。

弹性测定方法ARFI检查采用西门子S2000超声诊断仪进行，选用9L4探头。具体方法为：先对所选肝脏组织行二维超声检查，选取无明确管道组织的区域进行测定，将取样框置于所选区域后执行测定，每个肝叶均测定10次，取中位数作为有效数值(图1A)。所有测值均由2名有经验的超声医师共同完成。

2D-SWE检查采用AixPloxer实时组织弹性成像超声诊断仪进行，选用SL15- 4探头。具体方法为：二维检查后进入2D-SWE模式，调整彩色编码范围为0～40 kPa，将彩色编码框置于肝实质，待图像稳定3~5帧以后停帧，利用Q-BOX取样工具对感兴趣区内的LS进行测定。感兴趣区直径为3 mm，选取后自动计算该取样容积内LS的均值，每次测定均记录10个感兴趣区内肝脏弹性均值，最后取平均值作为最终结果(图1B)。所有测值均由2名有经验的超声医师共同完成。

ARFI：声辐射力脉冲成像技术；2D-SWE：二维剪切波弹性成像技术

ARFI：acoustic radiation force impulse；2D-SWE：two-dimensional shearwave elastography

A.ARFI检查；B.2D-SWE检查

A.ARFI examination；B.2D-SWE examination

图 1肝脏硬度测定示例

Fig 1The example of liver stiffness measurement

肝纤维化分期病理诊断标准LF的等级根据METAVIR系统进行评价，即：F0为无纤维化；F1为门管区少量纤维化，但无分隔形成；F2为少量分隔出现；F3为大量分隔出现，但并未形成假小叶；F4为假小叶形成[3- 4]。

统计学处理采用SPSS 20.0统计学软件。LS以均值±标准差表示，不同LF等级LS的差异采用方差分析进行比较，并依据最小显著性差异法进行两两比较。LF与LS之间的相关性根据Spearman等级相关分析进行统计。ARFI技术及2D-SWE技术测定LS对LF的诊断意义均采用构建受试者工作特性曲线的方法进行评价，计算其敏感度、特异度及约登指数，各LF等级诊断界值的选取以约登指数最大为准。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

模型建立结果共成功取得37只动物的实验数据，其中包括对照组8只、实验组29只。共计死亡动物23只，其中3只死于实验开始前2周的环境适应阶段(对照组1只、实验组2只)，17只死于建模过程中(对照组1只、实验组16只)，3只死于实验操作过程中的麻醉过量和操作不当(对照组1只、实验组2只)。所有动物均成功进行肝脏取材，其纤维化分级情况为：F0级14处、F1级11处、F2级15处、F3级12处、F4级22处(来源于动物12两处肝叶的组织中1处存在少量分隔，1处不存在，故而1处被判定为F1，1处被判定为F2等级)。

LS测定结果所有动物均成功进行LS的测定(图2)。不同LF等级动物利用ARFI测定所得LS差异具有统计学意义(F=27.336，P<0.001)，LF与LS呈线性相关(r=0.802，P<0.01)；不同LF等级动物利用2D-SWE测定所得LS差异具有统计学意义(F=52.262，P<0.001)，LF与LS呈线性相关(r=0.892，P<0.01)。进一步行两两分析显示，F3、F4等级动物与上一LF等级动物LS差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

ARFI及2D-SWE对LF的诊断实验评价结果成功构建利用ARFI测得LS及利用2D-SWE测得LS对于LF诊断效能的受试者工作特性曲线(图3)。ARFI测得LS诊断LF>F0的曲线下面积为0.809，诊断LF>F1的曲线下面积为0.916，诊断LF>F2的曲线下面积为0.938，诊断LF>F3的曲线下面积为0.934；2D-SWE测得LS诊断LF>F0的曲线下面积为0.917，诊断LF>F1的曲线下面积为0.935，诊断LF>F2的曲线下面积为0.976，诊断LF>F3的曲线下面积为0.974(表2)。

A.ARFI测定结果；B.2D-SWE测定结果

A.results measured using ARFI；B.results measured using 2D-SWE

图 2不同纤维化等级组织肝脏硬度箱图

Fig 2The box-plot of liver stiffness of tissue with different liver fibrosis grade

表 1　各纤维化等级动物的LS测定结果

LS：肝脏硬度；LF：肝脏纤维化；a：与上一LF等级进行比较

LS：liver stiffness；LF：liver fibrosis；a：the significance when LS value was compared with that of animals with lower grade LF

A.诊断0级以上纤维化；B.诊断1级以上纤维化；C.诊断2级以上纤维化；D.诊断3级以上纤维化

A.for the diagnosis of liver fibrosis higher than F0；B.for the diagnosis of liver fibrosis higher than F1；C.for the diagnosis of liver fibrosis higher than F2；D.for the diagnosis of liver fibrosis higher than F3

图 3肝脏硬度诊断不同肝纤维化等级的受试者工作特性曲线

Fig 3Receiver operating characteristic curve for LS in the diagnosis of LF at different grades

表 2　ARFI及2D-SWE对LF的诊断效能

讨论

超声弹性成像距今已有20余年的发展历史。从最早的震动弹性成像、压迫弹性成像，到近年来应用较多的瞬时剪切波弹性成像、ARFI及2D-SWE，弹性成像的技术手段经历了极大的发展和变化，其研究也逐渐从实验室走向临床，应用于肝脏、乳腺、前列腺及甲状腺等多种脏器的疾病诊断中[6]。其中，肝脏疾病的诊断是该技术应用发展最快、接受程度最高的领域之一。

目前，超声弹性成像在肝脏中的应用主要集中于对肝脏纤维化程度的无创性评估。自从2003年Sandrin等[7]利用瞬时剪切波弹性成像技术对LS进行测定，近10年各国学者进行了大量相关研究，使得LS在判定LF方面的意义被广为认可，亚洲太平洋肝病研究协会[8]和欧洲肝病学会指南[9]均已经将该技术进行了推荐。目前，弹性成像技术已经被应用于临床[10]，可反映LF程度及门脉压力的情况[11]。

尽管瞬时剪切波弹性成像在诊断LF等级方面有较大价值，但由于其激励源为机械振动，失败率较高[12]，大部分情况只能测定部分右肝距皮下25～65 mm的组织，且无法实时观测组织[13]，具有较大的局限性。近年来，ARFI技术的出现使得超声弹性成像得到了更进一步的发展，该技术利用声辐射力激发组织位移，与常规超声结合，可实时评估组织并选取感兴趣区，已被证明具有较好的诊断价值[14]。然而，不能实时彩色编码显示LS测定结果、取样框不可调及缺乏质控指标等缺点使得其应用仍然受到限制。

2D-SWE技术是弹性成像技术的最新发展成果，该技术利用超音速剪切波作为激励源，可实时显示LS的测定结果，已有研究证实其对LF具有较好的诊断价值[5]。尽管已有研究者利用行肝脏穿刺的患者对2D-SWE及ARFI技术进行了对比[15]，然而，由于肝脏穿刺本身存在较大的抽样误差等缺点，并不适合作为判定LF的金标准。另一方面，LF在各肝脏解剖位置的发展也不同步(本研究存在部分动物两个肝叶LF等级并不一致的情况)，因此，LS相关研究应当建立在整体病理结果的基础上，进行相同位置的测定，才能科学地进行比较。

由于临床研究很难得到各LF等级分布较为均衡的群体资料，且很难得到患者的整体病理标本，因此，本研究通过建立不同程度LF等级的动物模型，对相同病变部位同时进行ARFI和2D-SWE检查，并取病理标本，从而对ARFI和2D-SWE的诊断价值进行对比。

本研究表明，利用ARFI技术和2D-SWE技术测定LS所得结果与LF呈线性相关关系(r=0.802及r=0.892，P<0.01)，利用LS诊断LF，其诊断效果较好。本研究LS对LF的诊断效能明显优于目前国内外临床的报道[15]，笔者认为其主要原因可能是本研究采用动物建模的方法进行实验，病因单一，病情可控，不同疾病等级分布较为平均，且基本可以除外年龄、性别、体重指数、转氨酶水平、其他基础疾病等混杂因素的干扰[14]，因此诊断准确性较高，其结果也更为可信。

相比于ARFI技术，2D-SWE技术的诊断效能有明显改善，主要体现于较低等级LF的诊断效能上。尽管在方差分析进行两两比较时两种技术均只有在LF>F3之后才与前一LF等级出现差异，但利用2D-SWE技术进行LS测定对于LF>F0的诊断敏感度由ARFI技术的68.97%提高至77.59%，曲线下面积由0.809提高至0.917；对于LF>F1的情况下，2D-SWE的诊断敏感度由ARFI技术的77.55%提高至93.88%，曲线下面积由0.916提升至0.935。产生上述差别的主要原因可能为2D-SWE技术采用的单位为kPa，其测定结果更为准确，更能反映出较低级别LF的改变。另一个可能原因为2D-SWE技术采用彩色编码的方式实时显示感兴趣区内的LS变化情况，避免了激发过程中突然出现呼吸动度等其他干扰造成的误差，因此测量数值相对较稳定，具有一定的质控优势。此外，2D-SWE技术采用的取样容积本身可调节大小，较为灵活，在选取稳定的测量区域方面具有内在优势。

此外，本研究还体现了2D-SWE技术在诊断高级别LF时具有更好的特异性。对于LF>F3诊断的特异度，ARFI技术为73.08%，而2D-SWE为100%。该结果的出现笔者认为其核心原因仍然是2D-SWE技术在质控方面的优势导致其数据更加真实、稳定。由于在较高LF级别的肝脏中，肝窦内皮细胞功能破坏，其对于肝窦水平压力变化的调节能力降低[16]，此时较小的干扰即可出现较大的误差，因此对诊断技术稳定性的要求更高，两种技术测定的特异度差别也就更大。

当然，本研究也存在一定不足。首先，本研究采用了浅表探头进行LS的直接测定，尽管操作者对该操作非常熟练，但仍不可避免可能存在对脏器进行不同程度的压迫，从而成为实验的干扰因素。其次，尽管动物的呼吸动度已经在最大程度上进行了纠正，但仍然有可能对测定结果进行较小的干扰。最后，由于本研究为动物实验，其诊断界值无法直接应用于临床，为更好地应用仍需进一步行大样本的相关临床研究。

综上，本研究表明ARFI及2D-SWE技术均能较为准确地反应LF的等级，且2D-SWE技术的诊断效能优于ARFI技术，应当进一步进行必要的推广和研究，以应用于临床工作中的诊断评估和动态监测中。

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·论著·

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.02.005

Roles of Acoustic Radiation Force Impulse and Two-dimensional Shearwave Elastography in Grading Liver Fibrosis in Rabbits

LI Nan，LUO Yu-kun，TANG Wen-bo

Department of Ultrasonography，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

Corresponding author：LUO Yu-kunTel：010- 66939533，E-mail：lyk301@163.com

ABSTRACT：ObjectiveTo explore the difference between acoustic radiation force impulse(ARFI)and two-dimensional shearwave elastography(2D-SWE)in grading liver fibrosis(LF).MethodsSixty New Zealand rabbits were divided into control group(n=10；without any treatment)and LF group(n=50；treated with CCl4to induce LF at different degrees).Liver stiffness (LS) were measured in all the animals using ARFI and 2D-SWE，and liver tissues in the same sites were collected for pathological analysis.Spearman’s rank-correlation coefficient was used for analysis between LF and LS，and the receiver operating characteristic curve was constructed to analyze the difference of the diagnostic performance of the two techniques.ResultsData were obtained from 37 animals，among which 14 sites was at F0，11 sites at F1，12 sites at F3，and 22 sites at F4.All the LS measurements were successfully performed.A significant correlation between LS and ARFI results(r=0.802，P<0.01)as well as a significant correlation between LF and 2D-SWE results(r=0.892，P<0.01)were found.The receiver operating characteristic curves were successfully constructed.The area under the curve for diagnosing LF higher than F0，F1，F2 and F3 were 0.809，0.916，0.938，and 0.934，respectively，for ARFI，and those were 0.917，0.935，0.976，and 0.974，respectively，for 2D-SWE.ConclusionARFI and 2D-SWE can accurately grade LF，and 2D-SWE has a better diagnostic performance than ARFI.

Key words：acoustic radiation force impulse；two-dimensional shearwave elastography；live fibrosis；liver stiffness

(收稿日期：2015- 01- 22)

中图分类号:R445.1

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2015)02- 0157- 06

通信作者：罗渝昆电话：010- 66939533，电子邮件：lyk301@163.com