MMP-1、TIMP-2在下肢静脉曲张血管中的表达及意义①

许建辉，刘程伟，王 石，金 松，王树卿

(佳木斯大学附属第一医院血管外科，黑龙江 佳木斯 154003)

MMP-1、TIMP-2在下肢静脉曲张血管中的表达及意义①

许建辉，刘程伟，王 石，金 松，王树卿

(佳木斯大学附属第一医院血管外科，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：通过采集手术中的曲张和正常大隐静脉样本，研究在曲张大隐静脉中基质金属蛋白酶(MMP)-1和基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-2的表现变化及其意义。方法：收集佳木斯大学附属第一医院2013-12～2014-10通过血管外科收治的大隐静脉手术治疗患者32例(患肢40条)，选取男18例，女14例，年龄38～75岁，平均57.5岁。选取静脉主干曲张最明显的部位制作标本。依据CEAP法，将40条曲张大隐静脉分俩组：C1～C3组(患肢24条)、C4～C6组(患肢16条)。对照组选用一定期间我院骨外科和血管外科，由于动脉硬化闭塞症和外伤(没有下肢静脉曲张和静脉曲张家族史)需要截肢的正常10条大隐静脉。男性截肢者7例(患肢7条)，女性截肢者3例(患肢3条)，年龄24～70岁，平均46.6岁。本实验分为俩组实验组及其对照组，俩组的实验方法是通过免疫组化来显示MMP-1、TIMP-2在大隐静脉中的表达概率。结果：对照组大隐静脉壁中MMP-1的表达量较少，但是实验组曲张大隐静脉壁中表达量增多(P<0.05)，C4～C6组和C1～C3组表达率无统计学意义(P>0.05)。在对照组大隐静脉壁中TIMP-2也可以表达，但在实验组曲张大隐静脉壁中表达增加(P<0.05)，C4～C6组和C1-C3组表达率无统计学意义(P>0.05)。结论：静脉曲张的血管重塑可能与MMP-1、TIMP-2的异常表达相关。

曲张大隐静脉；MMP-1；TIMP-2；免疫组化

大隐静脉曲张在血管外科疾病中属于常见病之一，患病的人群比例较高，且与年龄呈正相关[1]。常发生老师、外科大夫、服务员、农民以及孕妇等这些长期久站或者体力劳动或久坐而不动的人群中。我国近几年患此类疾病的人群呈上升的趋势，因此，在物质和精神层面也给很多患此类疾病的家庭带来了负担，社会的经济负担也随之加重。当今，此类疾病的治疗有：保守治疗、手术治疗，无论哪种方法都复发率存在[2]。现如今这类疾病的发病原因的研究，对于诊疗和评估愈后有重要作用。基质金属蛋白酶(MMPs)是内源性蛋白水解酶的一种，其作用的发挥是通过Ca2+保障蛋白稳定性和Zn2+参与活性位点的双重作用。MMPs可降解除了多糖以外的各型细胞外基质蛋白。因此，静脉曲张血管重塑的过程MMP-1和TIMP-2可能参与了，并发挥作用。此次实验通过观测基质金属蛋白酶1和基质金属组织蛋白酶抑制剂2在曲张及正常大隐静脉中的表达量，来探究MMP和(或)TIMP与下肢静脉曲张的发病是否相关。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集佳木斯大学附属第一医院2013-12～2014-10通过血管外科收治的大隐静脉手术治疗患者32例(患肢40条)，选取男18例，女14例，年龄38～75岁，平均57.5岁。对照组选用一定期间我院骨外科和血管外科，由于动脉硬化闭塞症和外伤(没有下肢静脉曲张和静脉曲张家族史)需要截肢的正常10条大隐静脉。男性截肢者7例(患肢7条)，女性截肢者3例(患肢3条)，年龄24～70岁，平均46.6岁。按CEAP临床分级法，C0:不安定腿，可能是下肢静脉血栓后的表现。将40条曲张大隐静脉分俩组：C1～C3组(患肢24条)、C4～C6组(患肢16条)。正常的10条大隐静脉作为对照组。

实验试剂：兔抗人TIMP-2多克隆抗体、兔抗人MMP-1多克隆抗体、通用SP试剂盒、柠檬酸盐缓冲液、DAB显色试剂盒、PBS缓冲液。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化Sp法

取手术中大隐静脉远心端曲张明显的部位，长约1.5～3cm，对照组取正常大隐静脉相同位置处。标本固定于甲醛溶液中24h后，石蜡包埋，切片，厚度约5μm。使用免疫组织化学SP法对MMP-1、TIMP-2的表达情况进行记录，阴性对照：应用PBS缓冲液替换一抗,阳性对照应用已知MMP-1、TIMP-2在结肠癌中的阳性表达,实验过程严格操作，微波法修复抗原。

1.2.2 结果记录标准

在显微镜10个高倍镜下记录胞浆呈棕黄色匀称颗粒的阳性染色细胞数，用百分比( 阳性细胞数/总细胞数)记录。分四个等级：①>75%为()、②50%～75%为()、③25%～50%为(+)、④≤25%为(-)。

1.3 统计学方法

采用SPSS11.0统计学软件，对数据使用χ2检验、Fisher精确计算概率法，P<0.05，有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP-1的表达情况

在正常静脉壁中MMP-1的表达量较少，内皮细胞和平滑肌细胞胞质中是其表达部位所在；但是在实验组(C1～C3组和C4～C6组)中的MMP-1表达量较正常组增加，在曲张静脉排列紊乱的平滑肌细胞中呈成簇分布，C1～C3组与C4～C6组中的MMP-1表达量相比，无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 曲张静脉C1～C3组、C4～C6组、正常静脉组中MMP-1的表达

注：C1～C3组和C4～C6组与正常组的表达率是有统计学意义(P<0.05);C1～C3组与C4～C6组表达率没有统计学意义(P>0.05)。

2．2 TIMP-2的表达情况

TIMP-2阳性表达率在正常组中的是：20%；对照组(P<0.05)低于实验组 (C1～C3组和C4～C6组)的表达,C1～C3组与C4～C6组的TIMP-2表达相比，没有统计学意义(P>0.05)。TIMP-2同MMP-1的表达部位相同。见表2。

表2 曲张静脉C1～C3组、C4～C6组、正常静脉组中TIMP-2的表达

分组(-)(+)( )( )阳性率(%)正常(10)802020C1～C3(24)686475C4～C6(16)146593．75

注：C1～C3组和C4～C6组与正常组表达率有统计学意义(P<0.05);C1～C3组与C4～C6组表达率没有统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

大隐静脉曲张是下肢静脉曲张中最多见的，其发病因素有静脉血液反流内压上升、先天性瓣膜的缺陷、遗传、管壁薄弱等，多种因素作用使静脉壁变性、变形出现不规则的形态。内皮细胞的改变、平滑肌细胞的改变、细胞外基质的改变、血流动力学改变使其重要的病生理变化[3]。影响合成生理因子的功能和内皮细胞物质交换的因素有：①组织缺氧、②血液瘀滞、③静脉压升高等。内皮细胞受损可出现：①白三烯释放的量增多，白三烯进入静脉管壁内，促使平滑肌合成增多；②一氧化氮含量的增多血管平滑肌细胞收缩功能降低；③致使管壁发生曲张的内皮细胞内舒张因子合成量增多，曲张发生更容易。合成型平滑肌增多后会出现⑴ 胶原纤维增生、胶原化是由于正常的降解胶原不能被合成型平滑肌细胞降解；⑵细胞收缩能力减低，这是由于内膜增生，收缩功能蛋白分泌减少导致的[4]；⑶增加 静脉壁厚度等病理变化。胶原纤维和弹性纤维是细胞外基质中含量最高的，胶原纤维的增多，弹性纤维的减少可使静脉管壁的韧性降低，静脉迂曲扩张更容易。

MMPs为降解酶，存在于细胞外基质中，细胞外基质的合成及其降解受其调节。正常生理情况下呈低表达，当发挥生理功能时，受许多方面因素调控，其中包含：①抑制剂因素；②基因因素，重点在转录后调节影响酶功能[5]；③酶原活化因素。TIMPs对MMPs具有特异性，MMPs内源性抑制剂是TIMPs。目前TIMP有四种已被发现，此中非可溶性蛋白TIMP-3是唯一一个，其他三种全部都是可溶性。在正常生理状态下，身体中TIMPs和MMPs是拥有一个平衡态，平衡打破后，许多疾病就会随之出现。

MMP-1作为一种间质胶原酶类，能降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原的结构，使胶原变性，对酶的作用增强。在激活MMP-1以后，细胞外基质中的成分被降解，同时也破坏了血管的基膜，导致细胞发生转移、增殖，在肿瘤细胞转移、侵袭的过程中很常见，所以，在癌组织中MMP-1表达较高[6]。此次实验所得结果表明，MMP-1在正常对照组中表达量较低，而在实验组表达量较高，在C1～C3组表达率为62.5%，C4～C6组为87.5% ，相比较无统计学意义(P>0.05)，表达部位相同，在血管平滑肌细胞中，所以说MMP-1是在平滑肌细胞中产生的。TIMP-2能够与MMP-1结合，无论是活化还是非活化，结合后大大降低了MMP-1的水解作用。在转录发生时，TIMP-2起到抑制剂的作用，抑制转录。本次的所得实验结果提示，TIMP-2在正常对照组中呈现低表达，TIMP-2实验组中表达量呈现较高，有统计学意义(P<0.05)，血管平滑肌细胞胞浆和内皮细胞内为其阳性表达区域。TIMP-2在静脉曲张中表达较高，有助于细胞外基质聚集。

综上所述，MMP-1和TIMP-2的具体的作用机制不明确，仍需进一步的研究，但其异常表达参与了静脉曲张血管的重塑过程。

[1]KostasTI,IoannouCV,DrygiannakisI,etal.Chronicvenousdiseaseprogressionandmodificationofpredisposingfactors[J].JVascSurg, 2010,51(4): 900-907

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[4]成令忠,钟翠平,蔡文琴主编.现代组织学[M].上海: 上海科学技术文献出版社,2003

[5]NagaseH.Activationmechanismsofmatrixmetalloproteinases[J].BiolChem,1997,378:151-160

[6]胡明，刘振平，黄世杰,等.MMP-9在胃癌中的表达及与临床病理因素的关系[J].黑龙江医药科学，2013,36(5):18-19

教育部留学回国人员科研启动基金，编号：教外司留【2014】1685号。

许建辉(1990～)男，吉林四平人，在读硕士研究生，医师。

刘程伟(1976～)男，黑龙江佳木斯人，博士，副主任医师，副教授，硕士研究生导师。E-mail：liucwcw@163.com。

R543.6

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1008-0104(2015)04-0126-02

2015-03-16)