小白菊内酯对人肝癌细胞HepG-2细胞Caspase-3和NF-κB蛋白表达的影响①

韩琨景，杨万山，孙 抒，辛 悦

(1.延边大学医学院病理学与法医学教研室， 吉林 延吉 133002；2.白城市镇赉县人民医院 病理科，吉林 白城 137300 )

小白菊内酯对人肝癌细胞HepG-2细胞Caspase-3和NF-κB蛋白表达的影响①

韩琨景1，2，杨万山1，孙 抒1，辛 悦1

(1.延边大学医学院病理学与法医学教研室， 吉林 延吉 133002；2.白城市镇赉县人民医院 病理科，吉林 白城 137300 )

目的：研究小白菊内酯对人肝癌细胞HepG-2增殖抑制和诱导凋亡作用的机制。为小白菊内酯在临床上早日应用于肝癌患者提供理论及实验依据。方法：用体外培养的方法培养人肝癌HepG-2细胞；用四唑盐(MTT)比色法检测小白菊内酯对人肝癌HepG-2细胞的抗增殖及细胞毒作用；用倒置显微镜、HE染色光学显微镜；用免疫组织化学染色法检测小白菊内酯作用人肝癌HepG-2前后Caspase-3、NF-κB蛋白阳性表达变化的情况。通过以上实验研究小白菊内酯在体外对人肝癌HepG-2在细胞增殖、细胞凋亡等方面的影响及其作用机制。结果：(1)MTT法结果显示：小白菊内酯对人肝癌HepG-2细胞的作用影响具有浓度和时间依赖性；(2)细胞形态学观察：倒置显微镜观察到对照组细胞贴壁生长，伸展性良好，细胞呈梭形和多角形，细胞之间连接紧密。小白菊内酯作用人肝癌HepG-2 24h以后，增殖速度减慢，细胞贴壁能力下降，细胞之间连接疏松。药物作用48h以后，增殖速度大大减慢，大部分细胞变圆漂浮在培养瓶中。药物作用72h以后，几乎无活细胞，并且可见死细胞碎片；HE染色光学显微镜下观察：对照组细胞呈梭形和多角形，细胞之间连接紧密，细胞胞浆丰富，细胞核完整；药物作用24h以后，细胞伸展减弱，有一部分细胞呈现圆形，细胞之间连接疏松，核浓缩，染色质出现边聚；药物作用48h后视野中可见凋亡细胞和死亡细胞,细胞浆浓缩、染色质浓缩成新月形和“出泡”现象的变化；(3)免疫组化结果显示：实验组Caspase-3表达增加,NF-κB表达降低,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。结论：小白菊内酯对人肝癌HepG-2细胞有明显的抑制增殖作用，呈现出浓度和时间的依赖性；小白菊内酯对人肝癌HepG-2细胞株有诱导凋亡作用，其诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡机制可能与NF-kB、Caspase-3等信号转导有关。

小白菊内酯；人肝癌HepG-2细胞；增殖抑制；凋亡

小白菊内酯是小白菊的主要有效成分，它属于种半萜稀内酯化合物，也是西方的传统药物。近些年，国内科研工作者在中国特有的药用植物—木兰科观光木属植物宿轴木兰中也发现了此单体成分[1，2]，并通过现代色谱手段对木兰科观光木属植物宿轴木兰的所有单体成分的抑瘤活性进行分析，发现在木兰科观光木属植物宿轴木兰的所有单体成分中，小白菊内酯的抑瘤活性最强[3，4]。近些年的研究表明：小白菊内酯对很多种肿瘤都有抑瘤活性，如乳腺癌[5]、胆管癌[6]等，但目前针对现有文献来讲，有关小白菊内酯对人肝癌HepG-2细胞株作用影响的报道很少，这样就促使了我们对小白菊内酯作用于人肝癌HepG-2细胞的进一步研究。本论文中用体外培养的方法培养人肝癌HepG-2细胞；用四唑盐比色法(MTT法)检测小白菊内酯对人肝癌HepG-2细胞的抗增殖及细胞毒作用；用倒置显微镜、光学显微镜等观察小白菊内酯作用人肝癌HepG-2细胞前后细胞形态的改变；用免疫组织化学染色法通过检测药物作用前后细胞内相关基因蛋白Caspase-3、NF-κB蛋白阳性表达变化的情况来探讨小白菊内酯诱导细胞凋亡的可能机制。本研究以人肝癌HepG-2细胞为靶细胞，研究小白菊内酯对人肝癌HepG-2细胞的Caspase-3和NF-κB蛋白表达的影响并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物与主要试剂

小白菊内酯，购于北京华美生科生物技术有限公司，RPMI-1640培养液：碧云天试剂公司；胎牛血清：北京华美生科生物技术有限公司产品；二甲基亚砜：美国Amresco公司产品；免疫组化试剂盒：Caspase-3、NF-κB(一抗工作浓度1：100)购于武汉博士德生物有限公司；PBS缓冲液：购于武汉博士德生物有限公司。

1.2 主要设备

超净台：上海净化设备厂；二氧化碳培养箱：USA产品，TC2323-2E型；倒置显微镜：日本Olympus产品；离心机:Heraeus公司产品；酶联免疫检测仪：TECAN型号infiniteM200PRO；光学显微镜：日本Olympus产品。

1.3 细胞株与细胞培养

人肝癌HepG-2细胞株购于北京华美生科生物技术有限公司。人肝癌HepG-2细胞以适量浓度接种于含10%胎牛血清和100U/mL青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基中，置于温度37℃，二氧化碳浓度为5%及饱和湿度95%的二氧化碳培养箱中进行培养，每3天传代一次。

1.4 MTT比色法测定细胞增殖抑制率

将对数生长期的细胞接种于96孔板中，每孔180μL的细胞悬液，于温度37℃，二氧化碳浓度为5%及饱和湿度95%的二氧化碳培养箱中进行培养，待贴壁后每孔加入不同浓度的小白菊内酯20μL，各培养24、48h后，每孔加入20μL的MTT溶液。4h后再吸出液体，加入180μL的二甲基亚砜，轻微震荡后，再用酶联免疫检测仪在波长492nm处测其吸光值。

计算公式：细胞的增殖抑制率(%)=(1-加药组平均吸光值/对照组平均吸光值)×100%。

1.5 倒置显微镜观察

从二氧化碳培养箱中取出对数生长期的人肝癌HepG-2的细胞，显微镜下观察细胞状态后，待细胞贴壁后加入终浓度为5μg/mL的小白菊内酯，并设立对照组，对照组加等量的药物溶剂。加药组分别培养24h、48h、72h，用倒置显微镜观察、拍照并记录。

1.6 HE染色光学显微镜下观察

从二氧化碳培养箱中取出对数生长期的人肝癌HepG-2细胞，显微镜下观察细胞状态，消化后，加入新的培养液轻轻吹打制成浓度为10×104个/mL的细胞悬液。然后接种于6孔板中，放回二氧化碳培养箱中，第二天待细胞贴壁后，加药组加入终浓度为5μg/mL的小白菊内酯，对照组加等量的药物溶剂，48h后取出盖玻片进行HE染色。

1.7 免疫组织化学染色

加入新的适量的培养液吹打最终制成浓度为10×104个/mL的细胞悬液，最终将其接种在预先放有经多聚-L-赖氨酸处理的盖玻片的6孔板中，每孔加入1mL的细胞悬液，显微镜下观察后再放回二氧化碳培养箱内，第二天显微镜下观察待培养瓶内细胞贴壁后，加药组加入100μL最终浓度为5μg/mL的小白菊内酯，对照组加入等量的药物溶剂，48h后取出盖玻片按照SABC免疫组化染色试剂盒进行免疫组织化学染色。按照说明书操作。

结果判断标准：免疫细胞化学结果判定按文献介绍的染色强度计算法：无或染色极淡(阴性-)，浅棕黄色(弱阳性+)，棕黄色(阳性)，棕褐色(强阳性)。每张爬片以看到棕黄色为阳性表达，基因蛋白Caspase-3和NF-κB主要在胞质中或胞核与胞质中共同表达。每张爬片在40×10高倍镜下观察5个视野，在每个视野下分别计算阳性表达率，阳性表达率=(阳性细胞数/总细胞数)×100%。免疫细胞化学染色中以已知阳性物质的组织切片为阳性对照，各组均以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 MTT法检测小白菊内酯对人肝癌HepG-2的抑制增殖作用

MTT法检测结果显示：药物对人肝癌HepG-2细胞株有明显的抑制增殖作用，当药物处在同一个浓度时，随着药物对此细胞作用时间的延长，药物对其细胞的抑制率逐渐增加，与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)；另外，同一作用时间，随着药物浓度的增加，药物对细胞的抑制率也明显升高，具有显著性差异，见表1。

表1 小白菊内酯对人肝癌HepG-2细胞株的抗增殖作用(%

注: 相同时间不同剂量与前一组比较*P<0.05；相同浓度不同时间比较#P<0.05。

2.2 倒置显微镜观察结果

对照组细胞贴壁生长，伸展性良好，细胞呈梭形或多角形，细胞轮廓清晰。细胞之间连接紧密(图1A)；小白菊内酯作用人肝癌HepG-2 24h以后，增殖速度减慢，细胞贴壁能力下降，细胞体积缩小，细胞之间连接疏松，小部分细胞变圆漂浮在培养瓶中；药物作用48h以后(图1B)，增殖速度大大减慢，大部分细胞变圆漂浮在培养瓶中；药物作用72h以后，显微镜下观察几乎找不到正常细胞，大部分细胞都从瓶壁上脱落下来，并且可见死细胞碎片。

A：对照组

B：48h实验组

图1 倒置显微镜观察细胞形态(400×)

2.3 HE染色光学显微镜下观察结果

对照组细胞呈梭形和多角形，细胞之间连接紧密，细胞胞浆丰富，细胞核完整；小白菊内酯作用人肝癌HepG-2 24h以后，细胞伸展减弱，有一部分细胞呈现圆形，细胞之间连接疏松，核浓缩，染色质出现边聚；药物作用48h后视野中可见凋亡细胞和死亡细胞,细胞浆浓缩，染色质浓缩成新月形和“出泡”现象的变化。

2.4 小白菊内酯对肝癌细胞Caspase-3和NF-κB蛋白表达的影响

见表2。 光镜下观察：小白菊内酯作用于细胞后Caspase-3在细胞核和细胞质内的表达都有所增强，与对照组相比起来具有显著性差异 。NF-κB在对照组中高表达于细胞质和细胞核中，而药物处理后，NF-κB在细胞质中呈弱表达，与对照组相比具有统计学差异，见表2。

表2 用药前后Caspase-3和NF-κB的阳性表达率

注：对照组与加药组比较，二种蛋白阳性表达率均具有显著统计学差异P<0.01。

3 讨论

本论文针对不同浓度的小白菊内酯在不同时间段对人肝癌HepG-2的作用效应。相同浓度的小白菊内酯随着作用时间的延长，药物的抑制率逐渐增加，有统计学意义(P<0.05)。在同一时间段，随着药物浓度的增加，药物对细胞的抑制率也随着增加，有显著性差异。这就说明小白菊内酯在对人肝癌HepG-2的药物效应具有时间和浓度依赖性。本实验中发现：用5μg/mL的小白菊内酯处理人肝癌HepG-2细胞48h可以发现药物对细胞生长的抑制率可达到48.7%，接近于半数抑制浓度(IC50)。本论文中通过倒置显微镜、光学显微镜方法观察细胞各个时段的形态学变化，并从形态学上探讨小白菊内酯对人肝癌HepG-2的诱导凋亡作用。本实验通过倒置显微镜观察到：对照组细胞贴壁生长，伸展性良好，细胞呈梭形和多角形，细胞之间连接紧密。药物作用细胞24h以后，增殖速度减慢，细胞贴壁能力下降，细胞之间连接疏松，小部分细胞变圆漂浮在培养瓶中。药物作用48h以后，增殖速度大大减慢，大部分细胞变圆漂浮在培养瓶中。药物作用72h以后，几乎无活细胞，并且可见死细胞碎片。在本实验中，通过免疫组织化学染色法观察到：实验组中终浓度为5μg/mL的小白菊内酯作用于人HepG-2 48h以后，实验组的Caspase-3的蛋白表达与对照组相比明显增加，说明小白菊内酯诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的机制可能是通过激活Caspase家族中的Caspase-3实现的。小白菊内酯是NF-κB的有效抑制剂，它主要是通过阻断IκB的降解来阻碍NF-κB通路的。进而发挥各种作用[7，8]。本实验发现,小白菊内酯作用于人肝癌HepG-2细胞株后,NF-κB的表达下降，这就说明小白菊内酯抗人肝癌HepG-2的机制可能与阻碍了NF-κB通路有关。

[1]宋晓凯，吴立军，屠鹏飞．观光木树皮的生物活性成分研究[J]．中草药，2002，33：676-678

[2]陈智超，李秋柏，邵菁，等. 小白菊内酯对多发性骨髓瘤细胞的生长抑制及其凋亡诱导作用[J].中华医学杂志，2006，86(28)：1993-1996

[3]宋晓凯，吴立军，屠鹏飞，等．观光木根皮的ICR鼠体内抑瘤作用初步研究[J].沈阳药科大学学报，2001,18(4)：283-285

[4]宋晓凯，屠鹏飞，吴立军．木兰科植物中生物碱成分研究概况[J]．中国中药杂志，1999,增刊：168-169

[5]OkaD，NishimuraK，ShibaM，etal．SesquiterpenelactoneparthenolidesuppressestumorgrowthinaxenograftmodelofrenalcellcarcinomabyinhibitingtheactivationofNF—kappaB[J]．IntJCancer，2007，120(12)：2576-2581

[6]KimJH，LiuL，LeeSO，eta1．SusceptibilityofcholangioearcinomaceHstoparthenolide—inducedapoptosis[J]．CancerRes，2005，65(14)：6312-6320

[7]黄东胜，刘军伟，陈建峰，等.小白菊内酯对胰腺癌细胞BxPC-3增殖和凋亡的影响及机制[J].中国病理生理杂志，2008,24(4)：661-665

[8]颜建华，杨凤丽，刘岩. 小白菊内酯对3种人肿瘤细胞株和人脐静脉内皮细胞的抗增殖活性作用[J].国际肿瘤学杂志，2007,34(9)：720-720

Experimental study on the effect of parthenolide on human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells

HANKun-jing1，2,YANGWan-shan1,SUNShu1,XINYue1

(1.College of Medicine, Yanbian University College of Medicine, Yanji133002, China;2. People Hospital of Zhenlai County, Baicheng 137300, China)

Objective:To study the mechanism of action of parthenolide on human hepatocellular carcinoma HepG-2 cell proliferation inhibition and apoptosis induction effect; and to provide theoretical and experimental basis for parthenolide in clinical application as soon as possible in patients with hepatocellular carcinoma.Methods: Human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells were cultured the in vitro. cultured human hepatocellular carcinoma HepG-2cells; four tetrazolium (MTT) was used to detectthan the antiproliferative and cytotoxic effect of detection of parthenolide assay in human hepatocellular carcinoma cell line HepG-2.By inverted microscope, HE staining light microscope was used to observeation of parthenolide effect of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells and cell morphology change with the changes before and after drug detection.Immunohistochemistry staining of parthenolide was used to detect human hepatocellular carcinoma HepG-2 and expression of Caspase-3, NF- κB protein positive changes in the situation. Through the above experiment of parthenolide in vitro on human hepatocellular carcinoma HepG-2 effects on cell proliferation, apoptosis and its mechanism of action were studied.Results: (1) MTT method results showed that: the effect of parthenolide was dependent on the concentration and time in affecting human hepato cellular carcinoma HepG-2 cells. in a concentration and time dependent; (2) the morphology of cells was observed by inverted microscope observation. The : to control growth of adherent cells in control group was observed, stretching for good,Cells were spindle and polygonal cells wereare connected tightly. Parthenolide effect of human hepatocellular carcinoma HepG-2 24h, proliferation, cell adherence ability drops, loose connections between cells, some cells became round floating in the culture flask. After Ddrug effecteds after 48h, the proliferation speed slowed down considerably, Most of the cells became round floating in the culture flask. Drug effects after 72h, almost no live cells, dead cells and debris visible.We and observed under light microscope with HE staining: group cells were spindle and polygonal control, cells wereare connected tightly, rich in cytoplasm, nucleus integrity;drug effect after 24h, cell spreading weakened, some cells showed round, osteoporosis, connections between cells pyknosis, chromatin appeared margination; apoptotic cells and cell death after 48h in the view of drug effect, cytoplasm condensed, dyeing into crescent and the "bubble" phenomenon of condensation;(3) The results of immunohistochemistry showed that: the experimental group increased the expression of Caspase-3, but reduced the expression of NF- κB, which compared with the control group with significant difference (P<0.05). Conclusions: ①Parthenolide has obvious effect on inhibiting the proliferation of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells, showing a concentration and time dependence;②Parthenolide to induces the apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG-2,The possible mechanism of human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells inducesd apoptosis and NF-kB, Caspase-3 and other signal transduction.

parthenolide; human hepatocellular carcinoma HepG-2 cells; proliferation; apoptosis

吉林省中医药管理局基金项目，编号：吉中医药发2012-152。

韩琨景(1985～)女，吉林白城人，硕士，医师，研究方向：肿瘤病理学。

孙抒(1961～)女，辽宁开原人，博士，教授。研究方向：肿瘤病理学。E-mail：sunshu1@126.com。

R735.7

A

1008-0104(2015)04-0046-04

2015-02-09)