缬沙坦对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏骨桥蛋白、骨形成蛋白 7表达的影响①

刘中柱，刘艳姝，史为伍，姚海涛，牛效清，张国艳，何 琦

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

缬沙坦对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏骨桥蛋白、骨形成蛋白 7表达的影响①

刘中柱，刘艳姝，史为伍，姚海涛，牛效清，张国艳，何 琦

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

目的:本实验通过建立大鼠模型经病理学、免疫组化手段观察肾纤维化过程中OPN、BMP-7的表达，并用缬沙坦干预大鼠模型。研究血管紧张素II受体拮抗药物缬沙坦在肾间质纤维化(RIF)过程中的作用与机理。方法：选取 Wistar雄性大鼠36只，随机平均分3组(模型组、缬沙坦组，假手术组)，所有大鼠均制备单侧输尿管结扎(UUO)模型，假手术组不处理输尿管。用0.9%Nacl对假手术组、模型组每日一次等量灌胃。缬沙坦治疗组以6mg/kg缬沙坦给药量日一次灌胃。上述方法操作2w后，每组随机选取6只大鼠取血后处死取肾脏。其余大鼠继续上述方法处理至4w后同样方法取材及处死。用免疫组织化学方法检测肾组织中的OPN、BMP-7表达情况；所取血液使用我院全自动生化仪对血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)进行检测。结果:模型组和缬沙坦组在术后血肌酐及血尿素与假手术组比较都明显升高而且有统计学意义(P<0.05)。免疫组化法发现模型组OPN表达增加，BMP-7表达减少，而缬沙坦组OPN表达减少，BMP-7表达增加。Western印迹法测定OPN、BMP-7蛋白的表达。结论：缬沙坦可能在肾间质纤维化的过程中起到拮抗作用，可能对临床用药提供实验理论依据。

缬沙坦；骨桥蛋白；骨形成蛋白 7

慢性肾病(chronickidneydisease，CKD)是由多种因素引起的慢性肾脏结构改变和肾脏功能障碍的疾病。呈现进行性发展者是慢性肾脏病的严重类型，大多数结局都是发展为肾衰竭的终末期，需要肾移植治疗或终身透析。肾脏功能减退的程度，和肾小管间质纤维化的严重程度呈正相关。近年来，慢性肾病的患病发病率都在不断的上升，因此有效预防及治疗慢性肾衰竭对病人生活质量的提高，社会负担及生命延长都有重要意义[1]。肾间质纤维化(RIF)由许多病理生理等共同因素参与使细胞外基质(ECM)沉积过多引起。肾脏间质纤维化中细胞因子、炎症介质、血管活性物质相互作用影响。肾间质纤维化的过程与肾素-血管紧张素、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的上调密切相关。在其发生发展过程中肾素血管紧张素系统起着重要的作用，可通过阻断RAS对肾功进行保护[2]。OPN原位的表达也可由巨噬细胞趋化因子中的AngⅡ诱导，OPN据报导显示可以在诱导单核等炎细胞浸润的同时分泌生长因子；巨噬细胞也可合成RAS，进一步加强OPN的表达与巨噬细胞浸润;相当于一种恶性循环过程。血管紧张素受体拮抗剂(ACEI)类药物，通过血流与非血流动力学作用来对抗胞外基质沉淀，在多种动物模型中具起到保护肾脏的效果来减缓纤维化的发生发展[3]。缬沙坦是口服非肽类AngⅡ1型受体拮抗剂(AT1RA)，目前该药在肾脏病变中研究报导相对较少。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是肾间质中巨噬细胞被吸引的重要因子，广泛分布于多种细胞和组织内，它的表达量与间质炎症及纤维化程度紧密相关。而骨形成蛋白7(Bbonemorphogeneticprotein7，BMP-7)是一种内源性抗肾纤维化因子，在阻止肾纤维化方面起重要作用[4]。本实验拟通过建立UUO大鼠模型，应用缬沙坦进行干预，研究OPN和BMP-7在UUO模型中的表达情况，进一步讨论缬沙坦在肾间质纤维化发生发展中的作用。通过本次实验缬沙坦可能在肾间质纤维化的过程中起到拮抗作用，可能对临床用药提供实验理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型的选择与分组

购买雄性Wistar大鼠36只(体重190～210g)，随机平均分为3组(假手术组、模型组、缬沙坦治疗组)。所有大鼠都腹腔注射3%戊巴比妥钠(45mg/kg)麻醉后，无菌条件下行左侧腹切口(1～2cm)逐层切开腹部各层，缬沙坦治疗组和模型组大鼠均分离左侧输尿管后结扎并剪断，逐层缝合组织到皮肤。假手术组不处理输尿管仅是分离。

1.2 给药方法

用0.9%Nacl对假手术组、模型组每日一次等量灌胃。缬沙坦治疗组以6mg/kg缬沙坦给药量日一次灌胃。在给药持续两周后每组随机选取6只大鼠，取血后处死并取材。其它剩余大鼠继续用药至四周后同样按上述方法操作。

1.3 检测方法及主要观察指标

组织取材：用上述方法给药两周及四周后各组大鼠分别取内眦血，用生化分析仪测定血中肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)含量结果后分别处死剩余大鼠，均取出左侧肾脏经固定、包埋、切片等处理，用免疫组化法、Western印迹检测其中OPN和BMP-7的表达。

1.4 统计学方法

采用软件SPSS15.0秩和检验法分析，认为P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 2、4W时各实验组大鼠Scr和BUN比较

模型组与缬沙坦组大鼠术后2w、4w的Scr及BUN与假手术组比较，差异显着增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，缬沙坦组Scr及BUN术后2周和4周均较低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

表1 术后不同时间各组大鼠Scr值比较

※与对照组比较,P<0.01,★与模型组比较,P<0.05。

表2 术后不同时间各组大鼠BUN值比较

*与对照组比较,P<0.01,△与模型组比较,P<0.05。

2.2 免疫组化

假手术组BMP-7表达相对较高，OPN仅有少量表达。模型组OPN表达增加，BMP-7表达减少，而缬沙坦组OPN达减少，BMP-7表达增加。见表3、4。

表3 OPN在缬沙坦治疗组、模型组与假手术组中阳性面积百分比的表达

与假手术组比较P<0.01，与模型组比较P<0.01。

表4 BMP-7在缬沙坦治疗组、模型组与假手术组中阳性面积百分比的表达

与假手术组比较P<0.01，与模型组比较P<0.01。

2.3 Western blot测定各组大鼠肾组织OPN蛋白、BMP-7蛋白的表达

见图1～4。(1假手术组 2模型组 3缬沙坦组)。

图1 两周时大鼠肾组织OPN蛋白 Western blot

图2 四周时大鼠肾组织OPN蛋白 Western blot

图3 两周时大鼠肾组织BMP-7蛋白 Western blot

图4 周时大鼠肾组织BMP-7蛋白Western blot

3 讨论

慢性肾病的肾间质纤维化基本病理表现是肾小管萎缩和间质纤维化。由许多因素引起的ECM在肾间质内过度沉积，多种炎症细胞浸润肾间质，促进炎症细胞的浸润的细胞因子尚未完全明了[5]。肾间质巨噬细胞最重要的趋化因子就是受OPN的吸引，间质纤维化程度的高低与OPN的表达多少相关密切。巨噬细胞是炎症细胞，是启动肾间质纤维化病变的重要始动环节，可以引起大量炎性细胞浸润。骨形成蛋白7(bonemorphogeneticprotein-7，BMP-7)是TGF-β1发挥生物学作用的重要的下游调控介质。它在纤维化过程中起到负性调节作用，BMP-7通过多种途径对各种纤维化的逆转和预防各种纤维化疾病起作用，当然也包括肾纤维化过程[6～8]。那么我们也就有一种新的途径可以延缓或控制肾小管间质纤维化过程，就是以BMP-7为切入点来用药。有报道称BMP-7能通过抑制炎性趋化因子的释放、拮抗TGF-β1诱导的E-钙黏蛋白下调、促进ECM降解，来延缓肾病进展和肾纤维化[9]。缬沙坦作为血管紧张素受体拮抗剂，可以对抗细胞外基质沉积， 同时抑制OPN，使其难以活化进而控制肾间质纤维化发生发展的过程。本实验同时观察了OPN和BMP-7在缬沙坦治疗组、模型组与假手术组中的表达情况和缬沙坦治疗组、模型组中血肌酐和尿素氮结果的对比，发现OPN在缬沙坦治疗组的表达低于模型组，而BMP-7在缬沙坦治疗组的表达高于模型组。Westernblot测定各组大鼠肾组织OPN蛋白、BMP-7蛋白的表达结果与免疫组化结果符合，进一步证明缬沙坦可能对肾间质纤维化过程起到拮抗作用，可能对临床用药提供实验理论依据。

[1]SimonM,MareshJG,HarrisSE,etal.Expressionofbonemorphogeneticprotein-7mRNAinnormalandischemicadultratkidney[J].AmJPhysiolRenalPhysiol, 1999, 276(3):382-389

[2]VukicevicS,BasicV,RogicD,etal.Osteogenicprotein-1 (bonemorphogeneticprotein-7)reducesseverityofinjuryafterischemicacuterenalfailureinrat[J].JClinInvest, 1998,102(1): 202-214

[3]刘中柱，潘明阳，刘艳姝，等.厄贝沙坦对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化干预作用[J].黑龙江医药科学，2014，37(2)：50-51

[4]YangJ,LiuY.Dissectionofkeyeventsintubularepithelialtomyofibroblasttransitionanditsimplicationsinrenalinterstitialfibrosis[J].AmJPathol, 2001,159(4)：1465-1475

[5]姚双,康晓明,李丽.雷帕霉素对大鼠慢性肾间质纤维化中HGF.TGF-β1的表达的影响[J].黑龙江医药科学,2013,36(3)：11-12

[6]薛痕，樊均明．骨形成蛋白-7 与肾纤维化[J]．国外医学泌尿系统分册，2004，24(2)：246-250

[7]ZeisbergM,HanaiJ,SugimotoH,etal.BMP-7counteractsTGF-β1-inducedepithelial-to-mesenchymaltransitionandreverseschronicrenalinjury[J].NatMed, 2003,9(7): 964-968

[8]杨林，段惠军．骨形成蛋白-7 在肾纤维化中的作用[J]．河北医科大学学报，2006，27(3)：225-227

[9]GouldSE,DayM,JonesSS,etal.BMP-7regulateschemokine,cytokine,andhemodynamicgeneexpressioninproximaltubulecells[J].KidneyInt, 2002, 61(1): 51-60

佳木斯大学科学技术研究项目，编号:L2012-055

刘中柱(1964～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师， 硕士研究生导师。

刘艳姝(1972～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，副主任医师，硕士研究生导师。E-mail:liuyanshu1015@sina.com。

R693.+2

A

1008-0104(2015)04-0043-02

2015-03-18)