左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织中CAMKⅡ及NCX3表达的影响①

裴艳莹,邹艳红,王海燕,韩丽萍,赵里明

(佳木斯大学附属第一医院儿内科，黑龙江 佳木斯 154003)

左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织中CAMKⅡ及NCX3表达的影响①

裴艳莹,邹艳红,王海燕,韩丽萍,赵里明

(佳木斯大学附属第一医院儿内科，黑龙江 佳木斯 154003)

目的：通过建立氯化锂-匹罗卡品点燃的癫痫大鼠模型，应用左乙拉西坦(LEV)灌胃进行抗癫痫治疗，通过免疫组化方法观察海马区钙调素依赖蛋白激酶(CaMKⅡ)Ⅱ及钠钙交换体(NCX3)蛋白的表达变化，同时通过水迷宫测试观察长期应用对认知功能的影响。方法：3周龄健康Wistar大鼠120只分为生理盐水组、癫痫模型组、正常给药组及治疗组，应用氯化锂-匹罗卡品造模成功后7d、14d及28d断头取脑组织，应用免疫组化方法观察大鼠海马组织中CAMKⅡ及NCX3的表达变化，并且在第四周应用水迷宫评价每组大鼠的空间学习记忆的能力。结果：反复惊厥可导致大鼠海马神经细胞损伤，CaMKⅡ及NCX表达下降，与对照组相比，左乙拉西坦(LEV)可以改善细胞内钙超载，提高CaMKⅡ及NCX3蛋白的表达。同时第4周结果显示长期应用LEV不会出现CaMKⅡ的过量表达。结论：LEV能很好的控制癫痫发作，可能与其能提高CaMKⅡ及NCX3蛋白的表达有关，同时能通过控制癫痫的发作进而改善其反复发作后所造成的学习记忆能力下降。

左乙拉西坦；癫痫；钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ；钠钙交换体；认知

癫痫是一种由很多种原因所引起的脑部的慢性疾病，它是以大脑内的一些神经元群发生反复发作性的过度同步放电，引起突发性及暂时性的脑功能失常为特征。大多数癫痫患者起病于儿童时期，癫痫会引起记忆力减退、人格障碍、智力低下等表现，反复发作可以引起神经细胞丧失，引起认知功能损害，是癫痫患者生活质量受到严重影响。目前对于其明确的发病机制处于不完全了解阶段，可能与神经递质的异常、离子通道的异常、神经胶质细胞异常及免疫学异常有关。左乙拉西坦(LEV)是目前新型的抗癫痫药物,它具有抗癫痫作用，同时可以改善老癫痫药物的副作用，具有脑保护作用。钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是一种钙依赖性蛋白激酶，在脑组织中含量特别高，同时与记忆调控密切相关，被称为记忆分子。Looney等[1，2]多项研究证实癫痫患者海马区CaMKⅡa表达下调。钠钙交换体(NCX)3蛋白主要表达在CA1、CA3区锥体细胞及海马齿状回的颗粒细胞上，近年Pal和Raza等[3，4]研究发现，癫痫持续状态后Ca2+升高，而神经元的钙清除率却发生了急性和永久性的下降，因此钙稳态的失衡于钙移入机制的异常有关，NCX3蛋白作为电活动后主要的钙清除蛋白，它的下调可能成为致痫状态下造成机体钙稳态失衡重要原因之一。本研究通过建立匹罗卡品所点燃的癫痫模型大鼠，观察LEV在不同时间段对改善癫痫发作后的学习记忆能力及CaMKⅡ和NCX3蛋白表达的影响，从钙的离子通道的角度来探讨LEV的抗癫痫的作用机制，同时观察其对癫痫模型大鼠的学习及记忆能力产生的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物和模型制作

取3周龄健康Wistar大鼠120只，雌雄不限，随机分为4组，分别为生理盐水组(NS组27只)、左乙拉西坦对照组(LEV组27只)、癫痫模型组(Li-pilo组33只)，左乙拉西坦治疗组(Li-pilo+LEV组33只)。

根据文献[5，6]，Li-pilo组HELi-pilo+LEV组每组各27只大鼠首日腹腔注射1.27%氯化锂127mg/kg,24h后在给予M胆碱受体阻滞剂氨溴索东莨菪碱1mg/次，30min后腹腔注射匹罗卡品100mg/kg。观察大鼠行为，根据Racime标准[7]分级，达到Ⅲ～Ⅴ级的大鼠进入癫痫持续状态(statusepilepticus,SE)，归于致痫成功组；未达到Ⅲ～Ⅴ级的大鼠继续注射PILO直至次数达到6次，6次后仍未达到标准的归于致痫不成功组。当出现Ⅲ级以上癫痫持续发作30min，立即给予地西泮注射液10mg/kg终止发作，如控制不理想，可于20min后重复使用。对于造模成功的Li-pilo+LEV组和LEV组24h后给予LEV灌胃，剂量为200mg/kg，Li-pilo组和NS组灌注等量的生理盐，每天一次，在相同时间点给予连续灌胃。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化

于造模成功后第一周，第二周及第四周，从每组大鼠中随机取8只，在腹腔注射1%戊巴比妥纳液麻醉，迅速取出剪开颅骨取出海马组织, 固定于 4%多聚甲醛液。脑组织固定48h，取出后切成2mm厚的组织块；室温下进行梯度酒精脱水；二甲苯透明：二甲苯与无水乙醇混合液(4:1)5min，二甲苯5min，二甲苯3min；浸蜡：80%石蜡+20%二甲苯10min，石蜡中10min，石蜡中 30min；石蜡包埋：将组织块放入模型中，加入已融化的石蜡，放入冰箱，凝固变硬。蜡块放在4℃冰箱过夜；轮转式切片机切片，切片厚度3μm；将组织放入冷水，平摊于水面，附贴于L-多聚赖氨酸处理过的载玻片，短时放入温水将蜡溶解；37℃温箱内放置2h。HE染色，树胶封片备免疫组化用[8]。

1.2.2Morris水迷宫测试

在造模成功后第四周进行Morris水迷宫实验开始观察大鼠空间位置的学习能力。根据文献[9]，实验共需要6d，前 5d是空间定位航行实验(Placenavigationtest，PNT) ，是记录各组大鼠从入水开始到找到平台所需要的时间即“逃避潜伏期”。第1d不需要设立平台，将大鼠放入池中自由游泳60s，进行适应性的训练，从第2d开始连续4d( 每天4 次) 随机地在四个不同象限让大鼠面向池壁浸入水中，让大鼠寻找并逃避到平台，每次训练间隔30s。若在60s内大鼠无法找到平台，则由实验者引导其上平台。所有大鼠上台后均停留20s，以利于其对空间参照物的记忆。第6d上午为“空间探索实验”(Spatialprobetest，SPT) ，撤掉平台，记录大鼠60s内穿越平台次数(通过设置摄像系统及电脑路径软件记录大鼠穿越平台的次数)。

1.3 统计学方法

采用SPSS16.0软件进行统计分析，实验数据为计量资料，用表示，组间差异比较采用方差分析，有统计学意义时进一步用LSD法做两两比较。检验水准α为0.05。

2 结果

2.1 Morris 水迷宫测试

实验期间，不同组间Morris水迷宫实验的结果差异有统计学意义(P<0.05)，进一步做两两比较可知，LEV组与NS组差异无统计学意义，Li-pllo组与NS组、LEV组差异有统计学意义(P<0.05)，Li-pllo+LEV组与NS组、LEV组、Li-pllo组差异有统计学意义(P<0.05)。不同组间的大鼠穿越平台次数的差异有统计学意义(P<0.05)，进一步做两两比较可知，LEV组与NS组差异无统计学意义，Li-pllo组与NS组、LEV组差异有统计学意义(P<0.05)，Li-pllo+LEV组与NS组、LEV组、Li-pllo组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组Morris水迷宫实验的结果比较

注：a与NS组比较，P<0.05；b与LEV组比较，P<0.05；c与Li-pllo组比较，P<0.05。

2.2 免疫组化

CaMKⅡ和NCX3蛋白的免疫反应产物主要分布在海马区。各时间段在生理盐水组和左乙拉西坦对照组实验大鼠海马组织中CaMKⅡ和NCX3阳性细胞数比较，其差异无统计学意义(P>0.05)；各时间段模型组大鼠的海马组织中CaMKⅡ和NCX3阳性细胞数与生理盐水组比较降低，其差异有统计学意义(P<0.05)；各时间段左乙拉西坦治疗组大鼠的海马组织中CaMKⅡ和NCX3阳性细胞数与模型组比较增高，其差异有统计学意义(P<0.05)。见表2～3。

表2 各组大鼠海马组织中CaMKⅡ阳性细胞数比较(个/高倍视野

注：a与NS组比较，P<0.05；b与LEV组比较，P<0.05；c与Li-pllo组比较，P<0.05。

表3 各组大鼠海马组织中NCX3阳性细胞数比较(个/高倍视野

注：a与NS组比较，P<0.05；b与LEV组比较，P<0.05；c与Li-pllo组比较，P<0.05。

3 讨论

癫痫是慢性的反复发作性的一种短暂的脑功能失调综合征。其特征是出现脑部的神经元异常放电从而引起反复的痫性发作。癫痫会引起记忆力减退，人格障碍智力低下等表现。大量研究表明伴有意识丧失的全身性发作比局灶性发作更易引起认知功能的损害，其中又以强直-阵挛发作最为严重[10]。癫痫持续状态(SE)是指发作中完全恢复而又有另一次发作，总时间超过30min者。在边缘系统中，海马区是非常重要的，在学习及记忆的活动中表现明显。目前对于癫痫明确的发病机制处于不完全了解阶段,可能与神经递质的异常、离子通道的异常、神经胶质细胞异常及免疫学异常有关。关于离子通道异常，已有研究表明突变的Na+和K+通道与癫痫的发作有关[11]。离子的异常影响着神经元间信息的传递。钙在突触传递中起重要作用，当冲动传到突触前末梢，触发前膜中的Ca2+通道开放，有一部分突触泡在和突触前膜结合后出现开口，引起其内的神经递质释放到了突触间隙。被外排的递质通过扩散经过突触间隙来到突触后膜，然后同后膜内的受体相互结合，从而引起受体的变化，打开通道，此时特定的离子就可以顺浓度差异开始流入或者是流出。

新型的抗癫痫药左乙拉西坦(LEV)具有较独特的抗癫痫机制。在儿童的癫痫发作中有很好的疗效，已经有研究发现左乙拉西坦对儿童癫痫多种发作类型有显著效果，对大脑的认知功能基本无影响[12]。HelmstaedterC,等[13]对401名使用左乙拉西坦进行治疗的癫痫患者治疗前及治疗后3个月、6个月的客观及主观的认知功能进行对比研究，结果指出LEV能很好的控制癫痫发作且对患者主观和客观的认知能力有一定的改善作用。MichaelT等[14]报道3例小婴儿(最小患儿仅有2d)使用LEV能够完全控制发作且无不良反应。目前大量的研究和报道表明，LEV对于儿童癫痫具有良好的治疗效果，同时长期应用具有一定的安全性，LEV也具有良好的耐受性，目前无严重不良反应的报道，是目前较为理想的抗癫痫药物，目前对于LEV的作用机制与抗癫痫的关系尚不完全清楚，仍需要进一步的研究。

Na+-Ca2+交换体(Na+-Ca2+exchanger，NCX)是将电活动后胞内增加的Ca2+移出细胞的重要转运体。NCX3蛋白作为电活动后主要的钙清除蛋白，它的下调可能成为致痫状态下造成机体钙稳态失衡的另一重要原因。NCX3蛋白的主要表达在CA1、CA3 区锥体细胞及DG区的颗粒细胞胞膜上。当突触前膜上的NCX3 表达出现下调时，神经末梢质膜对升高的Ca2+的清除能力减弱，Ca2+迅速增加，进而促进囊泡与胞膜的融合，以致使神经递质的释放出现改变，当抑制性递质的释放与合成小于兴奋性递质的释放与合成，就可以引起癫痫的发作。Goussakov等[15]研究发现海人酸致大鼠苔藓纤维的末梢上释放到谷氨酸池中的谷氨酸较其他递质明显增大。有研究又进一步的证实了胞外谷氨酸的释放与增加同癫痫的发作密切相关。由此可见NCX3 的下调有可能破坏了中枢神经系统内兴奋与抑制之间的平衡，最终导致癫痫的发生。本实验结果显示癫痫大鼠海马组织中NCX3的表达出现下调，反映出NCX的表达与癫痫的发生密切相关。

钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ(CAMKⅡ) 是一种具有多功能的蛋白激酶，又被称为记忆分子，主要集中在大脑的海马组织中，它可以维持及改变神经递质的释放。在神经系统中，Ca2+主要是通过参与神经元突触前膜兴奋-分泌的偶联过程及行使突触后膜第二信使的作用来调节神经元的功能。研究发现进入胞内的Ca2+能够与已经存在于胞质内的钙调素蛋白质(CaM)相互结合，从而激活能够增加谷氨酸、5-HT等递质合成的蛋白激酶PKI-I,同时引起囊泡收缩释放递质。而大量研究报道各种递质，例如5-羟色胺5-HT、神经肽Y(NPY)等，与癫痫的发作有密切关系。本实验结果显示癫痫大鼠海马区CaMKⅡ的表达出现了下调，同时应用LEV没有出现实验后期CaMKⅡ过分的表达。已有研究表明，CaMKⅡ亚型中的CaMKIIβ亚型的过高表达是能够引起小鼠的记忆能力损害。故该实验反映出CaMKⅡ与癫痫的发作及癫痫后的认知功能的损害存在密切的关系。

实验结果显示癫痫发作的大鼠NCX3表达下调，与Canitano等实验结果一致，提示NCX3蛋白可能与癫痫发作相关。同时本实验与倪 宏等实验结果相符，对于癫痫大鼠海马钙调素依赖蛋白激酶(CaMKⅡ)的表达研究发现反复的惊厥可以导致大鼠海马神经细胞损伤，造成海马区CaMKⅡ 的表达出现下调。同时实验结果也显示长期使用左乙拉西坦并没有出现CaMKⅡ 的过量表达。而通过观察大鼠行为学变化及Morris水迷宫实验发现，癫痫发作后可以产生认知功能的损害，而左乙拉西坦对认知功能有一定的改善作用。

综合结果显示，LEV能很好的控制癫痫发作，并且对患者主观和客观的认知能力有一定的改善作用。其作用机制之一可能是通过上调海马区CaMKⅡ及NCX3蛋白的表达来实现对癫痫发作的控制作用，同时可能通过上调CaMKⅡ及减少癫痫发作来改善癫痫发作所造成的认知功能损害。癫痫的发作及认知功能非常复杂的，是由多种因素共同作用的结果，海马组织中CaMKⅡ及NCX3表达的上调是否是LEV控制癫痫发作及改善认知功能的作用机制还需进一步研究。

[1]HneyMR,DohanFCJr,DaviesKG,etal.SynaPtoPhysinimmunoreaetivityiNtemporallobeepilepsy-Assoeiatedhippoeampalselerosis[J].AetaNeuRopathol(Ber1),1999,98(2):179-185

[2]倪宏，姜玉武，丁美丽,等.对幼年大鼠青霉素点燃后慢性认知功能缺陷的分子机制研究[J].生物化学与生物物理进展，2009,3694):480-490

[3]PalS,SunD,LimbrickD,etal.Epileptogenesisinduceslong-termAlterationsinintracellularcalciumreleaseandssequestrationmecha-Nismsinhippocampalneuronalculturemodelofepilepsy[J].CellC-Alcium,2001,30:285-296

[4]RazaM,PalS,RafiqA,etal.Long-termalterationlfcalciumho-Meostaticmechanismsinthepilocarpinemodeloftemporallobeepil-Epsy[J].BrainRes,2001,93:1-12

[5]MullerCJ,ankstahM,GrotickeI,etal.Pilocarpinevslithium-pilocapineforinductionofstatusepilepticusinmice:developmentofspontaneousseizures,behavioralaterationsandneuronaldamage[J].EurJPharmacar,2009,619(13):15-24

[6]陈子怡，陈树达，周玉倩.匹罗卡品诱发癫痫持续状态大鼠模型的改良和鉴定[J].解剖学研究，2011,33(2)：131-149

[7]RacineRJ.Modificationofseizureactivitybyelectricalstimulation: Ⅱ.Motoreizure[J].ElectroencephalogrClinNeurophysiol,1972,32(3):281-294

[8]贾天明，刘 涛，栾 斌，等． 左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织中NCAM和GAP-43mRNA表达的影响[J]． 中国当代儿科杂志，2011，13( 5) : 428-431

[9]张岩，王海燕，王颖，等.左乙拉西坦对癫痫大鼠认知功能的影响[J].黑龙江医药科学，2013,36(2)：6-7

[10]MullerVT,GomesMD.Questionnairestudyofprimarycarephysicians’referralpatternsandperceptionsofpatientswithepilepsyinaBraziliancity[J].RevPanamSaludPublica,2007,22 (1):67

[11]JentschTJ,SteinV,WeinreichF,etal.Molecularstructureandphysiologicalfunctionofchloridechannels[J].PhysiolRev,2002,82:503-568

[12]VerrottiA，D'AdamoE，ParisiP，etal．Levetiracetaminchildhoodepilepsy[J]．PaediatrDrugs，2010，12( 3) : 177-186

[13]HelmstaedterC,WittJA.Theeffectsoflevetiracetamoncognition:amoninterventionalsurveillancestudy[J].MolPharmacol,2012,82(2):199-208

[14]KangJ,JiangL,GoldmanSA,etal.Astrocyte-mediatedpo-tentiationofinhibitorysynaptictransmission[J].NatNeurosci,1998,1:683-692

[15]GoussakovIV,FinkK,ElgerCE,etal.MetaplasticityofmossyFibersynaptictransmissioninvolvesalteredreleaseprobability[J].JNeurosci,2000,20:3434-3441

The effect of levetiracetam on the expression of CAMK II and NCX3 in hippocampus of rats with epilepsy

PEIYan-ying,ZOUYan-hong,WANGHai-yan,HANLi-ping,ZHAOLi-ming

(The First Hospital Affiliated to Jiamusi University,Jiamusi 154003,China)

Objective:To observe the effects of levetiracetam(LEV) on spatial learning and memory ability at epileptic rat and the expression of CaMK Ⅱand NCX3 in the hippocampus of rats with epilepsy induced by lithium pilocar-pine.The abilitiesy of learning and memory in each group rats wereas evaluated by the Morris waster maze. Methods: 120 healthy Wistar rats aged 3 weeks were randomly divided into normal saline group, treatment group, model group and normal dose group. Intraperitoneal injection of lithium-pilocarpine induced epil-epsy model, 7th day , 14th day and 28th day after successful model building.Then we detecteds hippocampus’expression levels of the CaMK Ⅱand NCX3 in each group rats. In the 4th week, to evaluate the abilitiesy of learning and memory in each group rats were evaluated by the Morris water maze. Results:Repeated seizures can cause rats hippocampus nerve cells damage and be able to the decrease of the CaMKⅡand NCX3 protein. Compared with he control group, LEV can improve the intracellular calcium overload, which improved CaMKⅡand NCX3 protein express-ion. At the same time, the results the fourth week of showsed that ,long- term useage of itLEV could not lead tonot be too mu-ch CaMKⅡand NCX3 protein expression.Conclusions:LEV can be a very good control epileptic seizures which may be related to increase CaMKⅡand NCX3 protein expression. Through the control of seizures after to improve att-ak caused by the ability of learning and memory.

levetiracetam(LEV);epilepsy;CaMKⅡ;NCX;Cognition

黑龙江省高校科技创新项目，编号：2012TD013。

裴艳莹(1987～)女，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。

王海燕(1957～)女，黑龙江佳木斯人，学士，主任医师，教授，硕士研究生导师。E-mail:276137680@qq.com。

R742.1

A

1008-0104(2015)04-0031-04

2015-03-10)