苦参碱诱导宫颈癌Siha细胞凋亡的机制研究

赵生华

陇西县中西医结合医院妇产科，甘肃 陇西 748100

宫颈癌(cervical carcinoma)是发病率仅次于乳腺癌的常见妇女恶性肿瘤，据统计，我国每年约有近10万新发病例，且每年约有3万妇女死于宫颈癌［1］，严重威胁妇女的身体健康。目前宫颈癌的主要治疗方法为外科手术和以铂类药物为基础的化疗，化疗是晚期复发转移患者的姑息治疗手段及手术或放疗的辅助治疗手段，但化疗药物具有严重的恶心、呕吐及肾功能损害等毒副作用，使如何减少化疗药物的用量及毒副作用成为广大肿瘤研究者的奋斗目标，近年来中药以其抗肿瘤、增强机体免疫、使用安全无明显毒副作用等优点，已成为抗肿瘤治疗的研究热点。苦参碱(Matrine)是从中药苦参中提取的一种生物活性成分，具有抗氧化、抗心率失常，抗炎，抗病毒，调节免疫，保肝等作用［2］。近年来研究发现，苦参碱可明显抑制肿瘤细胞的增殖，没有化疗药物的毒副作用，在胃癌、肝癌、肺癌、白血病中研究较多［3-5］，但对宫颈癌Siha细胞的研究尚少，本实验旨在探讨Mat对宫颈癌Siha细胞的增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制，为Mat应用于宫颈癌的临床治疗提供实验依据，探讨其在妇科恶性肿瘤治疗中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 细胞株 宫颈癌Siha细胞购于中国科学院上海细胞生物学研究所。用含10%胎牛血清和1OOU/mL青霉素、100 pg/mL链霉素、2%谷氨酰胺的RPMI-1640培养液，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下半贴壁细胞悬浮培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2 药物与试剂 苦参碱注射液(纯度＞98.0%，西安天园生物制剂厂)，RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司，批号：121207)，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司，批号：120416)，Survivin抗体(美国Santa Cruz公司，批号：111228-2)，RPMI-1640培养液（上海元龙生物技术有限公司，批号：120523）、小牛血清(美国Gibco公司,批号：130112)，MTT(美国 Sigma公司,批号：100819)、二甲基亚砜(美国Sigma公司，批号：100911)、琼脂糖(美国 Sigma公司，批号：101011)，TRIzol试剂(美国Invit rogen生命技术公司,批号：110924)，TaqDNA聚合酶(美国Promage公司，批号：120102)，Ol igod(美国Promage公司，批号：110419)，RNAsin(美国 Promage公司，批号：120812)，引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.3 主要仪器和设备 8000 DH直热型NAPCO CO2培养箱(美国赛默飞世尔科技公司)，IX-70型倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，FACSIO1型流式细胞仪(美国BectonDickinson公司)，Powerwave X酶标仪(美国 Bio-TEK公司)，MJ PTC-220 PCR仪(美国M.J.Research公司)，Rotor Gene 3000型实时定量PCR仪(澳大利亚Corbet t Research公司)。

1.4 方法

1.4.1 SRB(sul forhodamine B，磺基罗丹明B)法检测 苦参碱对宫颈癌细胞增殖抑制影响取对数生长期的Siha细胞用0.25%胰蛋白酶消化吹打，制成1×105/mL单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100μL，培养24小时。将Siha细胞分为Mat组及对照组分别加药。Mat组的终浓度依次为：0.25、0.5、1.0，2.0mg/mL。以不加药组为对照组(细胞悬液100μL、培养液100μL)，另设调零孔(只加培养液200μL)，每个浓度设5个复孔。继续培养 24小时和72小时，每孔加10%(w/v)三氯醋酸4℃固定1小时后用蒸馆水洗4～5次，瞭干后，每孔加0.4%(w/v)SRB 100mI在室温染色20分钟，然后用1%醋酸轻洗5次除去非特异性结合的染料，甩干，每孔加10mmol/LTris-base溶液(pHlO.5)150μL溶解，用酶联免疫检测仪测定510 nm处吸光度值。实验重复3次。使用酶标仪在490 nm处测吸光度(OD值)。细胞增殖抑制率=(对照组OD值-药物组OD值)/对照组OD值×100%。

1.4.2 Annexin V FITC/PI 双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率将对数生长期的Siha细胞制成1×105/mL细胞悬液，接种至培养瓶中，在37℃、5%CO2培养箱培养过夜。加入苦参碱使其终浓度分别为 0、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL，培养至 48小时后，用0.25%胰蛋白酶消化，收集1×106/mL细胞1mL，1 000rpm4℃离心10分钟弃上清，加入5mL预冷的PBS重悬细胞，再重复离心，弃上清，加入200μLAnnexin-V缓冲液重悬，再加入10μLAnnexin V-FITC和5μLPI，室温避光孵育20分钟，加入400μLAnnexin-V缓冲液，立即用流式细胞仪检测细胞凋亡率并分析细胞周期。重复3次。

1.4.3 倒置相差显微镜检测 将Siha细胞以3×l04个/孔的密度接种于24孔培养板中，在37℃、5%CO2培养箱培养过夜。待细胞贴壁后，加入终浓度为 0、0.25、0.5、1.0和 2.0 mg/mL的苦参碱。作用24小时后，在倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化并照相。

1.4.4 MDC染色检测自噬 将Siha细胞接种于预先放置载玻片的6孔培养板中，在37℃、5%CO2培养箱培养过夜。待细胞在载玻片上贴壁后加入终浓度为1mg/mL的苦参碱。继续培养24小时后，弃培养液，用0.05 mMMDC在37℃蜉育10分钟染色标记自噬泡。然后用PBS漂洗细胞3次，立即用荧光显微镜检测并照相。

1.4.5 实时定量RT-PCR检测促凋亡基因Bax和自噬相关基因Becl in 1的mRNA表达水平 取对数生长期的 Siha细胞，加入苦参碱使其终质量浓度分别为 0、0.25、0.5、1.0和 2.0 mg/mL，继续培养24小时后，用Trizol试剂提取细胞总 RNA，电泳检测RNA，用TaKaRa公司的PrimescriptTM RT reagent kit试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA。用SYBR Green I荧光染色法和Rotor Gene 3000 real-time PCR仪进行实时定量PCR。引物由大连宝生物技术有限公司合成。引物序列为：Bax 5′-TGCTTCAGGGTTTCATCCAG-3′(上游引物)，5′-GGCGGCAATCATCCTCTG-3′(下游引物)，Becl in1 5′-GAGGGATGGAAGGGTCTAAG-3′(上游引物)，5′-GCCTGGGCTGTGGTAAGT-3′(下游引物)，p-actin 5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′(上 游 引 物 )，5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′(下游引物)，β-action为内参照基因，反应条件为：首先95℃预变性2分钟，然后95℃变性10秒，60℃退火/延伸 20秒，共45个循环。并用2%琼脂糖凝胶电泳来证实PCR产物的片段大小为目的基因产物。通过Rotor-Gene Real-Time Analysis Sof tware 6.1.81软件来计算目的基因的相对表达量。

1.5 统计学方法 数据分析采用SPSS 16.0统计软件，计量资料用(χ±s)表示，用 t检验，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 对Siha细胞增殖的抑制作用 不同浓度Mat作用于Siha细胞24和72小时后，均不同程度抑制其生长，并且随着Mat浓度增加及培养时间的延长，抑制作用也在增强，呈现时间－剂量依赖性；各剂量组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2.2 苦参碱对Siha细胞周期和凋亡的影响 不同浓度苦苦参碱作用于Siha细胞后，流式细胞仪测定细胞周期分布发现，与对照组相比，G0-G1期逐渐增加，S期、G2-M期细胞比例逐渐降低，表明苦参碱将Siha细胞阻滞在细胞周期的G0-G1期，见图1。并且随着剂量的增加，Siha细胞凋亡率明显增加(P＜0.05)，见表2。

图1 苦参碱对Siha细胞周期分布的影响

表2 不同浓度Mat诱导宫颈癌Siha细胞的凋亡率

2.3 倒置相差显微镜显示细胞质中有空泡形成 不同浓度苦参碱干预24小时后，用倒置相差显微镜可观察到在细胞质中出现大量大小不等的空泡，随着苦参碱浓度的增加，细胞质中空泡逐渐增大增多，细胞不能贴壁而悬浮在培养液中。(见图2—3)。

图2 、3 参碱干预后宫颈癌Siha细胞形态学改变

2.4 MDC染色荧光显微镜检测 可见苦参碱组比未处理组显示更强的荧光信号和更多的MDC标记颗粒，MDC能够被细胞吸收并显示于自噬泡上，此时用荧光显微镜观察时，在胞质或核周区域可见到清晰的点状结构，因此可根据荧光显微镜下细胞内颗粒的变化来判断细胞内自噬水平。苦参碱组比对照组显示更强的荧光信号和更多的MDC标记颗粒，表明苦参碱能诱导自噬泡的形成，见图4。

图4 MDC染色荧光显微镜检测参碱干预后自噬泡

2.5 苦参碱上调Siha细胞Bax和Becl in 1 mRNA表达 上述实验结果显示，在苦参碱抗肿瘤过程中，自噬和调亡均被激活，而Becl in1是第一个被确认的哺乳动物自噬基因，在自噬形成过程中与Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositide 3-kinase，PI3K)形成复合体招募泛素样结合系统结合到隔离膜，促进自噬的发生，因此是自噬形成的早期阶段所必需的。而在细胞调亡过程中，p53上调Bax基因表达，Bax在线粒体上形成通道，使线粒体中的细胞色素C释放到胞质，最终激活天冬氨酸特异性半脱氨酸蛋白酶-3(cysteine-containing aspartate-speci f ic protease，caspase-3)而导致细胞凋亡。因此我们进一步检测自噬和调亡发生过程中的两个关键分子的mRNA表达水平是否在苦参碱干预后升高。如图5所示，实时突光定量RT-PCR结果表明苦参碱以剂量依赖方式上调Bax和Beclin 1 mRNA的表达水平。

图5 苦参碱上调Siha细胞Bax和Becl in 1 mRNA表达水平，*P<0.01，**P<0.001。

3 讨论

人们早已发现从中草药及天然植物中提取的活性成分具有抑制肿瘤细胞的增殖、杀伤肿瘤细胞的作用，如临床上常用的抗癌药物如长春新碱、紫杉醇等最早都是从天然中草药中提取成分，跟踪分离筛选、结构改造与化学合成的。因此，寻找高效、低毒的新型抗肿瘤药物势在必行，苦参碱是从豆科槐属植物中提取的一种生物碱，为白金雀儿碱的异构体，属于四环的喹诺里西淀类，主要来源于苦参、山豆根和苦豆子等，广泛分布于我国西北地区［6］。苦参碱于1958年首次成功分离，作为一种生物碱类活性成分，近年来发现其对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，且毒副作用较小。研究证明Mat有减轻放化、疗毒副作用、升高白细胞、提高机体免疫力，逆转肿瘤细胞的多药耐药，增加化疗药对肿瘤细胞的敏感性［7-8］。

本实验采用SRB法观察苦参碱作用Siha细胞24、48、72小时后的抑制率，结果表明，苦参碱能明显抑制宫颈癌细胞增殖，随着苦参碱浓度的增高，抑制作用也在增强，呈时间剂量依赖性，镜下观察细胞发现实验组Siha细胞由原来的多边形，贴壁、形态饱满，连接成片变成体积缩小、变圆，脱落悬浮于培养液中，胞质、胞核颜色加深。另外其细胞周期分布也明显改变，停滞于G0-G1期的细胞比例明显增加，而进入G2-M期和S期的细胞比例明显下降，并且这种阻滞效应具有一定的剂量依赖性。提示苦参碱对Siha细胞的增殖抑制作用可能是通过改变细胞周期的分布，使多数细胞停滞于细胞分化期即G1期，阻止细胞向S期转化，减少了DNA合成和阻止细胞有丝分裂，抑制细胞增殖。

细胞凋亡是由基因控制的细胞程序性死亡，研究发现肿瘤的发生、发展及恶化不仅与细胞的增殖分化异常有关，还与其凋亡障碍有关［9］。文献报道苦参碱亦能诱导肝癌细胞、胆囊癌细胞、胰腺癌细胞和白血病细胞凋亡［10-11］。本研究采用Annexin-V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测结果显示，苦参碱以剂量依赖方式诱导Siha细胞调亡，用 0.5、1.0、2.0mg/mL的苦参碱处理 Siha细胞后，调亡率分别为 (0.20±0.13)%、(72.92±3.41)%、(77.75±2.19)%和 (83.28±2.75)%。Siha细胞凋亡率随着苦参碱剂量的增加而明显升高，而对照组细胞只发生了自然凋亡。

当药物导致细胞DNA严重损伤难以修复时，p53启动细胞调亡程序。p53上调Bax基因表达，Bax蛋白在线粒体上形成通道，使线粒体中的细胞色素C释放到胞质，最终激活caspase-3而导致细胞调亡。本实验的实时突光定量RT-PCR结果显示苦参碱能够上调促凋亡基因Bax的mRNA表达水平，呈时间剂量依赖性。该结果和别的研究结果一致，Luo等［12］报道苦参碱通过上调促调亡分子Bak、Bax和Bim的表达水平而诱导胃癌MKN45细胞调亡。

我们用倒置相差显微镜观察到苦参碱处理后在细胞质中出现大量的、大小不等的空泡，并且随着苦参碱浓度的增加，细胞质中空泡逐渐增大增多。突光显微镜观察MDC染色标记自噬泡的结果也支持苦参碱诱导自噬。

大量研究表明自噬和肿瘤存在相关性，而且自噬具有抑制肿瘤的作用。Becl in 1是酵母ATG6/Vps30基因的哺乳动物同源基因，位于人类染色体17q21，是哺乳动物第一个被确认参与自噬过程的基因［13］。Aita等［14］报道在卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌中，Beclin 1单等位基因缺失分别达到75%、50%和40%。小鼠Becl in 1基因的杂合突变导致细胞增殖水平增强和自噬水平降低，并且Becl in 1突变小鼠的肿瘤发生率升高，如淋巴瘤、肺癌和肝癌［15］。Becl in 1蛋白和/或mRNA的表达水平在很多肿瘤细胞或癌组织常常降低或缺乏，如乳腺癌、卵巢癌、脑部肿瘤、宫颈癌和胃癌［16］。Karantza-Wadswor th等研究了Beclin 1等位基因缺失促进乳腺肿瘤形成的机理，结果表明自噬功能不全会增加DNA损伤和基因组不稳定性并最终导致乳腺癌的发生［17］。这些研究结果表明自噬在抑制肿瘤的发生中具有重要作用。

Becl in 1在自噬中是作为Ⅲ型PI3K复合体的一部分发挥作用，而Ⅲ型PI3K复合体是自噬形成的早期阶段所必需的［18］。在本研究中，我们观察到苦参碱上调Becl in 1的mRNA表达水平，呈时间剂量依赖性，表明苦参碱通过上调自噬相关基因Becl in 1的表达而诱导Siha细胞自噬。

本实验对苦参碱对宫颈癌抗肿瘤机制研究的探讨，使得我们利用凋亡、自噬机制治疗肿瘤成为可能，从中寻找治疗肿瘤靶点。

［1］ Parkin DM，Bray F，Fer lay J，et al.Estimating the wor ld cancer burden:Globocan 2000［J］.InT Cancer，2001，94:153-156.

［2］ 许红兰.苦参的药理研究进展［J］.现代医药卫生，2008，24(20):3066-3067.

［3］ 殷飞，赵军艳，姚树坤.苦参碱对SMMC-7721细胞MAPK、JAK、STAT信号通路的影响［J］.肿瘤防治研究，2008，35(2)：84-87.

［4］ 郭启帅，黄曦，李少林.苦参碱诱导卵巢癌 SKOV3细胞凋亡的机制研究［J］.中国药理学通报，2010，26(8):1104.

［5］ 周娟，倪松石，贲素琴.苦参碱对人肺腺癌A549细胞增殖及HIF-1α、VEGF表达的影响［J］.山东医药，2012，52(3):25.

［6］ 李河璟，王小龙.苦豆子及其利用［J］.甘肃农业科技，2010，48(2):46-47.

［7］ 李旭芬，张苏展，郑树，等.苦参碱对K562及多药耐药细胞K562/vin的细胞生物学影响［J］.中国病理生理杂志，2002，18(10)：1233.

［8］ 李文瑜，李舜华，崔克义，等.苦参碱逆转的白血病多药耐药细胞系K562/AO2对柔红霉素耐药性的研究［J］.中国病理生理学杂志，1998，14(5)：521-524.

［9］ Otsuki T，Kanno T，Fujita Y，et al.Adenosinereceptor-mediated p53-dependent apoptosis in lu-65human lung cancer cel ls［J］.Cel l Physiol Biochem，2012，30(1):210.

［10］ Liu T，Song Y，Chen H，Pan S，et al.Mat rine inhibits prol iferation and inducesapoptosis of pancreatic cancer cel ls in vit ro and in vivo［J］.Biol Pharm Bul l，2010，33(10):1740-1745.

［11］ Jiang H，Hou C，Zhang S，et al.Mat rineupregulates the cel l cycle protein E2F-1 and t riggers apoptosis via the mitochondrialpathway in K562 cel ls［J］.Eur J Pharmacol，2007，559(2-3):98-108.

［12］ Luo C，Zhu Y，Jiang T，et al.Matrine induced gastric cancer MKN45 cel ls apoptosis via increasing proapoptoticmolecules of Bcl-2 fami ly［J］.Toxicology，2007，229(3):245-252.

［13］Liang XH，Jackson S，Seaman M，et al.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by becl in 1［J］.Nature，1999，402(67):672-676.

［14］Aita VM，Liang XH，Murty VV，et al.Cloning and genomic organization of becl in 1，a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21［J］.Genomics，1999，59(1):59-65.

［15］ Yue Z，Jin S，Yang C，et al.Beclin 1，an autophagy gene essential for ear ly embryonic development，is a ha-ploinsuf ficient tumor suppressor［J］.Proc Nat l Acad Sci USA2003，100(25):5077-5082.

［16］Wang ZH，Xu L，Duan ZL，et al.Becl in 1-mediated macroautophagy involves regulation of caspase-9 expression in cervical cancer HeLa cel ls［J］.Gynecol Oncol，2007，107(1):107-113.

［17］Karantza WV，Patel S，Kravchuk O，et al.Autophagy mitigates metabolic stress and genome damage in mammary tumorigenesis［J］.Genes Dev 2007，21(13):1621-1635.

［18］Kihara A，Kabeya Y，Ohsumi Y，，et al.Becl in-phosphatidyl inositol 3-kinase complex functions at the t rans-Golgi network［J］.EMBO Rep，2001，2(4):330-335.