以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值

袁　凯，梁　德，吴雪琼，姚珍松，晋大祥，杨志东，张顺聪，丁金勇，江晓兵，陈建庭

1广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科，广州 510405

2中国人民解放军第309医院全军结核病研究所全军结核病防治重点实验室，北京 100091

3南方医科大学南方医院脊柱骨科，广州 510515



以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值

袁凯1，梁德1，吴雪琼2，姚珍松1，晋大祥1，杨志东1，张顺聪1，丁金勇1，江晓兵1，陈建庭3

1广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科，广州 510405

2中国人民解放军第309医院全军结核病研究所全军结核病防治重点实验室，北京 100091

3南方医科大学南方医院脊柱骨科，广州 510515

摘要：目的评价以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的酶联免疫斑点(ELISPOT)技术在脊柱结核感染辅助诊断中的应用价值。方法选取2012年5月至2013年12月广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科和南方医科大学南方医院脊柱骨科收治的疑似脊柱结核患者91例，根据临床和细菌性诊断结果分为脊柱结核组(n=52)和对照组(n=39)。采用ELISPOT试验检测脊柱结核组和对照组外周血单个核细胞，观察斑点形成细胞的数量。患者同时接受结核菌素(PPD)皮肤试验、血清抗结核抗体检测、病灶病理学检查、抗酸杆菌涂片和病灶结核分枝杆菌培养，比较不同检测方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值，分析不同检测结果的一致性。结果52例脊柱结核患者中共47例接受病灶活检穿刺病理检查，其中41例病理证实为结核。ELISPOT试验在脊柱结核诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为82.7%、87.2%、89.6%和79.1%；PPD皮肤试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为61.5%、46.2%、60.4%和47.4%；血清抗结核抗体试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为55.8%、61.5%、65.9%和51.1%。在脊柱结核患者中，ELISPOT试验的阳性率显著高于PPD皮肤试验(82.7%比61.5%，χ2=5.786，P=0.016)和血清抗结核抗体试验(82.7%比55.8%，χ2=8.847，P=0.003)，与病理学检查比较差异无统计学意义(82.7%比87.2%，χ2=0.396，P=0.529)。ELISPOT试验与病理学检查一致性较好(87.2%，κ=0.498，P=0.001)。结论以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的ELISPOT法应用于脊柱结核诊断有良好的敏感性和特异性，可作为脊柱结核感染辅助诊断的有效方法。

关键词：脊柱结核；酶联免疫斑点试验；CFP10/ESAT6融合蛋白；辅助诊断

Diagnostic Value of Enzyme-linked Immunospot Assay Using CFP10/ESAT6 Fusion Protein as Antigen in Spinal Tuberculosis

YUAN Kai1，LIANG De1，WU Xue-qiong2，YAO Zhen-song1，JIN Da-xiang1，YANG Zhi-dong1，ZHANG Shun-cong1，DING Jin-yong1，JIANG Xiao-bing1，CHEN Jian-ting3

1Department of Spine Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of

ActaAcadMedSin，2015,37(1)：44-49

脊柱结核是最常见的骨关节结核，约占骨结核的50%，占所有结核的1%~3%[1]。脊柱结核发病隐匿，进展迟缓，症状体征不明显，因此早期诊断非常困难。传统的结核病检测方法(结核菌素试验、涂片染色镜检、结核分枝杆菌培养和分子生物学方法)检出率明显低于肺内结核，严重影响患者的预后，致残率高。

酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunespot，ELISPOT)是根据酶联免疫吸附试验原理建立的一种体外检测单细胞水平特异性抗体分泌细胞功能的免疫学技术。目前的T-SPOT.TB试剂盒(英国Oxford Immunotec公司)是采用结核分枝杆菌特异的早期分泌抗原靶6kDa蛋白(early secretory antigentic target 6kDa protein，ESAT- 6)和培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP10)多肽刺激结核致敏T淋巴细胞分泌干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，并应用ELISPOT检测分泌IFN-γ的T淋巴细胞[2]。近年来，采用ELISPOT 技术定量检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)对结核分枝杆菌抗原的特异性释放反应开始被广泛用于肺外结核感染的诊断[3]，但将其单纯应用于脊柱结核感染诊断的研究较少。本研究初步探讨以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的ELISPOT技术用于辅助诊断脊柱结核感染的应用价值。

对象和方法

对象选取2012年5月至2013年12月广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科和南方医科大学南方医院脊柱骨科收治的疑似脊柱结核患者91例。自行设计患者信息采集表，收集基本临床信息和临床结果，并对受试者出院进一步随访。根据患者最终的临床诊断和细菌学诊断结果，由不知晓ELISPOT结果的主治医师将入选患者按照以下标准分为脊柱结核组(n=52)和对照组(n=39)。

脊柱结核组入选标准为：(1)患者影像学具备脊柱结核特征；(2)术前或术中活检病灶标本培养出结核分枝杆菌，或者病灶组织标本病理检查符合结核改变；(3)菌种鉴定排除非结核分枝杆菌感染；(4)脊柱结核患者抗结核治疗少于2周；(5)排除HIV感染。该组包括男31例，女21例，平均年龄(42.3±18.4)岁(2~86岁)；合并高血压3例，乙肝5例，梅毒2例，强直性脊柱炎1例，类风湿性关节炎2例，系统性红斑狼疮2例，肝硬化1例，肺结核7例；参考Jung等[4]的诊断标准，有10例脊柱结核患者合并免疫功能缺陷。

对照组入选标准为：(1)非脊柱结核疾病住院患者；(2)与脊柱结核组无血缘关系；(3)排除结核分枝杆菌感染；(4)影像学检查无结核表现；(5)无结核患者接触史；(6)排除HIV感染。该组包括男17例，女22例，平均年龄(46.5±13.9)岁(18~69岁)；其中确诊为腰椎间盘突出症16例，颈椎病6例，脊柱转移瘤5例，脊柱椎管内肿瘤8例，化脓性脊柱炎4例；脊柱转移瘤患者中有2例合并免疫功能缺陷[4]。

本研究方案经医院伦理委员会批准，所有入选患者均签署知情同意书。

主要仪器及设备酶联斑点分析仪为美国Cellular Techology Ltd.公司产品，由中国人民解放军第309医院结核病研究所免费进行检测；96孔细胞培养板为美国MILIPOR公司产品。CFP10/ESAT6融合蛋白由中国人民解放军第309医院结核病研究所提供[5]；结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)购自广州龙成药业有限公司；链亲和素-碱性磷酸酶、5-溴- 4-氯- 3-吲哚磷酸盐(5-bromo- 4-chloro- 3-indolyl phosphate，BCIP)和硝基蓝四氮唑(nitro blue tetrazolium，NBT)底物、人IFN-γ捕获抗体和人IFN-γ检测抗体购自瑞士Mabtech AB公司；植物血凝素购自美国Sigma公司；淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque PLUS)购自美国GE公司；人抗结核杆菌酶联免疫分析试剂盒购自上海奥普生物医药有限公司；罗氏培养管购自河南美凯生物有限公司。

ELISPOT试验包被微孔板上每孔加入100 μl稀释IFN-γ捕获单克隆抗体，4 ℃冰箱过夜。每位患者采集3~4 ml外周血，用淋巴细胞分层液分离(23 ℃，2500 r/min，离心20 min)、提纯PBMC，调节细胞浓度至2.5×106/L。

每个样本使用3个孔检测分泌IFN-γ的T细胞：在阴性对照孔内加入完全细胞培养液50 μl，在阳性对照孔内加入阳性对照植物血凝素50 μl，在检测孔内加入CFP10/ESAT6融合蛋白50 μl。在3个孔内加入100 μl含2.5×105个PBMC的悬液，将微孔板置于37 ℃含5%CO2的孵箱中孵育20 h。弃上清液，裂解细胞后，用200 μl 1×PBS洗板7次，每次l min。每孔加入100 μl的检测抗体，37 ℃孵育1 h。洗板后，每孔加入100 μl链亲和素-碱性磷酸酶，室温孵育30 min。洗板后，每孔加入100 μl新鲜配制的BICP/NBT底物。显色15 min，可见板底显示紫色斑点，用灭菌水洗板终止反应。每1个点代表1个分泌IFN-γ的T细胞，采用酶联斑点分析仪计数着色的斑点。

结果判断标准：阴性对照孔和阳性对照孔起质量控制作用。根据前期实验受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线确定的阳性阈值[6]，阳性结果的标准为：(1)空白对照孔斑点数<17时，检测孔斑点数-空白对照孔斑点数≥17；(2)空白对照孔斑点数≥17时，检测孔斑点数≥空白对照孔斑点数×2。如果不符合上述标准且阳性对照孔正常(阳性对照孔斑点数应>20个或遍布整个反应孔)，检测结果为阴性(图1)。

ELISPOT试验的标准化与质量控制由于ELISPOT试验的敏感性很高[6]，斑点形成容易受到诸多因素影响。本课题组前期的相关研究已建立了一套标准化的实验操作规范[6]。该项检测由1名经过严格ELISPOT检测培训的人员完成，并且检测过程中确保了实验设备、试剂、耗材的选择标准化。

抗酸杆菌涂片及抗结核抗体检测将术前穿刺和术中收集的脓液标本经离心沉淀，少量生理盐水混匀沉淀物，均匀涂抹于载玻片上，自然干燥后行抗酸染色镜检。采用人抗结核杆菌酶联免疫分析试剂盒检测抗结核抗体。

结核分枝杆菌培养将术前穿刺和术中收集的脓液标本经消化处理，接种于罗氏培养管内，37 ℃培养4~8周，每周观察1次，记录培养结果。

PPD皮肤试验在抽完静脉血(ELISPOT使用)后，吸取0.1 ml PPD稀释液(含5 U PPD)注射于前臂掌侧皮内。于注射后72 h检查注射部位反应，硬结的横径及纵径的平均数≥5 mm为阳性。

统计学处理采用SPSS 13.0统计软件，以敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值来评价各种检测方法；计数资料以率表示，采用χ2检验，两两样本率的比较采用χ2分割法；不同检测方法间一致性比较采用Kappa一致性相关分析；P<0.05为差异有统计学意义。

结果

标本获取及检测情况入选的91例患者均接受了ELISPOT、PPD皮肤试验和血清抗结核抗体检测。脊柱结核组中有47例接受了活检穿刺病理检测，42例行抗酸杆菌涂片检查，40例行结核分枝杆菌培养(表1)。

ELISPOT试验与临床常用诊断方法比较脊柱结核组中病灶抗酸杆菌涂片和结核分枝杆菌培养的阳性率分别为35.7%和57.5%。本研究91例患者中，ELISPOT试验呈阳性结果的有48例(图1)。PPD皮肤试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为61.5%、46.2%、60.4%和47.4%；血清抗结核抗体试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为55.8%、61.5%、65.9%和51.1%；ELISPOT试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为82.7%、87.2%、89.6%和79.1%。在脊柱结核组中，ELISPOT试验的总体阳性率显著高于PPD皮肤试验(P=0.016)和血清抗结核抗体试验(P=0.003)(表1)。经配对χ2检验，脊柱结核组中ELISPOT试验结果与PPD皮肤试验(P=0.013)和血清抗结核抗体试验(P=0.003)结果比较差异有统计学意义，与病理学检测结果比较差异无统计学意义(P=0.688)(表2)。对脊柱结核组患者中ELISPOT试验结果与PPD皮肤试验、抗结核抗体试验和病理学检查结果进行一致相关性分析的结果显示，病理学检查与ELISPOT试验结果一致性较好(87.2%，κ=0.498，P=0.001，表3)。

讨论

目前脊柱结核的诊断主要依据患者的临床表现、影像学检查及病灶的病理改变。细菌学检查是脊柱结核确诊的重要方法，但其培养技术仍然滞后，阳性率较低，现行的实验室病原学检测及菌种鉴定方法远不能满足临床辅助诊断的需求[7]。本研究中脊柱结核组患者病灶结核分枝杆菌培养的阳性率仅为57.5%。免疫学检查的价值虽然不如细菌学检查，但较为简便、快速，又有一定的敏感性和特异性，不失为辅助诊断结核病的有效方法，尤其适用于肺外结核患者[8]。

近年来发展起来的ELISPOT技术是一种新型的免疫酶技术，为早期发现结核病提供了新的方向[9- 10]。在结核性胸膜炎、皮肤结核、骨结核等肺外结核的辅助诊断中，ELISPOT显示了良好的敏感性和特异性[11- 14]。Hill等[15]研究表明，以CFP10/ESAT6融合蛋白刺激T淋巴细胞可取得同样的检测效果。本课题组前期研究证实，以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的ELISPOT技术在肺结核中有良好的诊断效果[16]。刘菲等[17]研究结果表明，ESAT6/CFP10-ELISPOT可作为辅助诊断初治肺结核的较为准确的方法。本研究也显示了以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的ELISOPT技术在脊柱结核辅助诊断中的应用价值，而且通过基因工程大量制备重组蛋白的费用低于多肽合成，故本方法可以明显降低检测费用。

本研究中，ELISPOT技术在脊柱结核患者中的诊断阳性率为82.7%，显著高于PPD皮肤试验的61.5%和血清抗结核抗体试验的55.8%。Lai 等[13]采用T-SPOT.TB试剂盒检测骨结核的阳性率为86.7%(其中9例脊柱结核的阳性率为100%)，但该试剂盒的特异性为61.9%，本研究所采用ELISOPT的特异性为87.2%。脊柱结核组52例患者中有47例接受了病灶组织活检，其中经病理确诊的41例患者中有37例ELISPOT结果呈阳性；病灶结核分枝杆菌培养阳性的23例患者ELISPOT结果均为阳性。在脊柱结核患者中，ELISPOT试验的阳性率与病理学结果的阳性率比较差异无统计学意义，且一致性较好。上述结果提示，CFP10/ESAT6-ELISPOT技术可为脊柱结核感染患者提供有效的辅助诊断依据，特别是在患者病灶无法获得、暂无细菌学结果时。

表 1　脊柱结核组中ELISPOT试验与临床常用结核诊断方法的比较(n=52)

ELISPOT：酶联免疫斑点；PPD：结核菌素纯蛋白衍生物；与ELISPOT比较，aP=0.016，bP=0.003

ELISPOT：enzyme-linked immunospot；PPD：tuberculin purified protein derivative；aP=0.016，bP=0.003 compared with ELISPOT

A.对照组(非脊柱结核疾病)ELISPOT结果阴性；B.脊柱结核组ELISPOT结果阳性

A. negative result of ELISPOT assay in a patient in the control group(non-spinal tuberculosis)；B. positive result of ELISPOT assay in a patient in the spinal tuberculosis group

图 1ELISPOT检测外周血中分泌干扰素-γ的淋巴细胞的代表性结果

Fig 1Representative results of ELISPOT assay detecting interferon-γ-secreting lymphocytes in peripheral blood

表 2　脊柱结核组ELISPOT检测与PPD皮肤试验、抗结核抗体试验和病理学检查的配对比较(n)

表 3　脊柱结核组中ELISPOT试验与PPD皮肤试验、抗结核抗体试验和病理学检查的一致性分析

本研究也存在一些不足。在入选的52例脊柱结核患者中，有10例合并免疫功能缺陷，其中仅1例PPD皮肤试验呈阳性，5例ELISPOT结果呈阳性。PPD皮肤试验结果在很大程度上受患者免疫功能的影响，合并免疫功能缺陷的结核患者PPD阳性率较低[4]，因此本研究中PPD阳性率偏低。由于这部分病例较少，笔者没有分亚组讨论ELISPOT技术在脊柱结核合并免疫功能缺陷患者中的诊断应用价值，可作为下一步研究的方向。同时，本研究组计划进一步通过多中心、大样本研究，验证ELISPOT技术在脊柱结核感染诊断中的应用价值。综上，以CFP10/ESAT6融合蛋白为抗原的ELISPOT技术检测脊柱结核感染有良好的敏感性和特异性，可考虑作为脊柱结核感染的重要辅助诊断方法。

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·论著·

Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China

2Army Tuberculosis Key Laboratory，Institute for Tuberculosis Research，the 309th

Hospital of PLA，Beijing 100091，China

3Department of Spine Orthopedics，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China

Corresponding author：LIANG DeTel：020- 36591604，E-mail：liangde99@sina.com

ABSTRACT：ObjectiveTo establish a method of detecting spinal tuberculosis(TB)infection by enzyme-linked immunospot(ELlSPOT)assay and evaluate the value of CFP10/ESAT6 fusion protein for diagnosis of spinal TB.MethodsSuspected spinal TB patients were prospectively recruited in two hospitals(First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine；Nanfang Hospital，Southern Medical University)from May 2012 to December 2013. Data on clinical characteristics of the patients and conventional laboratory results were collected. Compare and analyze the positive detection rate in spinal TB diagnosis by different methods including ELISPOT detection and conventional detection methods. Results47 patients with spinal TB had available biopsy or surgical specimens for histopathological examination and 41 specimens had pathological features consistent with a diagnosis of TB infection. Among the spinal TB patients and non-TB disease patients，the overall sensitivity，specificity，positive predictive value，and negative predictive value of the ELISPOT assay in spinal TB diagnosis were 82.7%，87.2%，89.6%，and 79.1%，respectively；the 4 indexes of the PPD skin test were 61.5%，46.2%，60.4%，and 47.4%，respectively；those of the antibody detection were 55.8%，61.5%，65.9%，and 51.1%. The positive rate of ELISPOT was significantly higher than those of PPD skin test and antibody detection test(82.7% vs. 61.5%，χ2=5.786，P=0.016；82.7% vs. 55.8%，χ2=8.847，P=0.003)，but not significantly different from the positive rate of pathological examination(82.7% vs. 87.2%，χ2=0.396，P=0.529). Moderate agreement was found between pathological examination and the ELISPOT assay(87.2%，κ=0.498，P=0.001). ConclusionWith high sensitivity and specificity，the ELISPOT assay using CFP10/ESAT6 fusion protein as antigen is an effective technique for auxiliary diagnosis of spinal TB.

Key words：spinal tuberculosis；enzyme-linked immunospot assay；CFP10/ESAT6 fusion protein；auxiliary diagnosis

收稿日期：(2014- 05- 12)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.01.008

中图分类号:R529.2

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2015)01- 0044- 06

通信作者：梁德电话：020- 36591604，电子邮件：liangde99@sina.com