微小RNA- 132转染对体内外肝癌生长和凋亡的作用

刘海斌，华　莹，金洲祥

温州医科大学附属第二医院肝胆外科，浙江温州 325000



微小RNA- 132转染对体内外肝癌生长和凋亡的作用

刘海斌，华莹，金洲祥

温州医科大学附属第二医院肝胆外科，浙江温州 325000

摘要：目的观察转染微小RNA- 132(miR- 132)对体内外人肝癌细胞株MHCC97H生长和凋亡的影响，初步探讨其作用机制。方法采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测45例肝癌组织及癌旁正常组织中miR- 132的表达，CCK- 8法、流式细胞术、裸鼠体内成瘤实验和TUNEL实验检验转染miR- 132后对体内外MHCC97H细胞生长和凋亡的作用，Western blot法检测体外MHCC97H细胞中p-AKT、Survivin和Caspase 3蛋白的表达，免疫组织化学法检测体内肿瘤组织中Ki- 67、Survivin和Caspase 3的表达。结果miR- 132在肝癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织(P<0.05)。在体外实验中，与空白对照组和阴性对照组相比，转染组细胞中miR- 132的表达明显升高，细胞増殖明显被抑制，G0/G1期细胞比例明显上升，S期细胞比例明显下降，凋亡细胞显著增加(P均<0.05)。转染组细胞中Survivin和p-AKT的表达下调，Caspase 3的表达上调，与空白对照组和阴性对照组相比，差异均有统计学意义(P均<0.05)。在体内实验中，转染组裸鼠皮下移植瘤生长明显被抑制，凋亡肿瘤细胞明显增加，Survivin和Ki- 67蛋白表达下调，而Caspase 3表达增加(P均<0.05)。结论转染miR- 132对体内外肝癌细胞有增殖抑制和凋亡诱导作用，miR- 132有望成为肝癌治疗的新靶点。

关键词：肝癌；微小RNA- 132；凋亡

ActaAcadMedSin，2015,37(1)：30-36

微小RNA(microRNA，miRNAs)是一种内源性非编码小分子RNA，在组织炎症反应、细胞增殖与凋亡、组织分化以及恶性肿瘤发生和发展等多种生理过程中发挥着重要的作用[1]。其中，miR- 132是当前研究热点之一，miR- 132不仅在结肠癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤细胞中表达下调，同时与恶性肿瘤的转移有着密切的关系[2- 3]，有望成为抑制恶性肿瘤的新作用靶点。为了进一步明确miR- 132调控恶性肿瘤生物学行为中的作用机制，本研究采用PCR技术，观察了miR- 132在肝癌组织和癌旁正常组织中的表达差异，并通过转染miR- 132至肝癌细胞，检测了其对体内外肝癌细胞增殖和凋亡的影响，初步探讨了miR- 132作为治疗肝癌新靶点的价值。

材料和方法

标本来源45例肝癌组织标本取自2006年1月至2013年1月在温州医科大学附属第二医院肝胆外科行手术切除的肝癌及对应的癌旁正常组织手术标本。其中，男21例，女24例，中位年龄51岁(28～82岁)。所有病例均经术后经病理检查证实为肝细胞癌，术前均未行放化疗，全部标本取材后迅速置于-80 ℃冰箱保存备用。

主要试剂胎牛血清、RPMI- 1640培养基和含0.25%EDTA胰蛋白酶购自美国Gibco公司，CCK- 8试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司，细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)和磷酸化蛋白激酶B(phosphorylase-protein kinase B，p-AKT)抗体购自美国Epitomics公司，Survivin、Caspase 3和β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司，CyTM3标记miRNA- 132 mimic和miRNA- 132错义链购自锐博生物科技有限公司，SYBR实时荧光定量试剂盒、Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit、U6 snRNA real-time PCR Normalization Kit和脂质体LipfectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，TUNEL试剂盒购自深圳晶美生物技术有限公司，免疫组织化学SP试剂盒购自德国宝灵曼公司。

细胞株和实验动物人肝癌细胞株MHCC97H购自中国科学院上海细胞库，细胞培养在含l0%胎牛血清、质量浓度1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI- 1640培养液中，置于37 ℃、5%的CO2的培养箱内培养，2～3 d换液1次，细胞单层贴壁生长至70%～80%融合时胰蛋白酶消化传代。4～6周龄雌性BALB/c-nu/nu品系的裸鼠，体重18～20 g，购自中国科学院上海动物实验中心，饲养于温州医学院动物实验中心SPF级屏障系统的洁净层流架内，室温控制在(25±1)℃，相对湿度为40%～60%。

RT-qPCR检测肿瘤组织中miRNA- 132的表达用Trizol试剂提取肿瘤组织及癌旁正常组织中的总RNA，按说明书操作。总RNA经紫外分光光度计测定260 nm与280 nm处光密度比值(D260/D280)为1.9～2.1，琼脂糖凝胶电泳法检测总RNA纯度。采用PrimeScript逆转录试剂盒进行逆转录，SYBR实时荧光定量试剂盒进行实时定量PCR检测，反应在25 μl体系中进行，反应条件：50 ℃下30 min逆转录，94 ℃变性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸7 min。以U6 snRNA作为内参，miR- 132的相对表达量采用2-△△Ct计算。

miR- 132转染及分组将处于对数生长期的MHCC97H细胞按4×106个/孔接种到6孔板，每孔2 ml，细胞贴壁后分3组：(1)空白对照组：在培养基中加入浓度为50 nmol/L的Lipofectamine 2000；(2)阴性对照组：每孔加入50 nmol/L的CyTM3标记miRNA- 132错义链；(3)转染组：在培养基中加入浓度为50 nmol/L的CyTM3标记miRNA- 132 mimic。培养24 h后收集细胞，在荧光显微镜下观察转染效率。

RT-qPCR检测miR- 132转染后miR- 132的表达转染48 h后收集细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA并检测RNA的完整性和纯度，按照Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit说明书进行操作，以U6 snRNA作为内参，miR- 132的相对表达量采用2-△△Ct计算。

CCK- 8法检测细胞增殖将转染后培养24 h的MHCC97H细胞制成单细胞悬液，以每孔4×103个细胞接种到96孔板，每孔200 μl，细胞贴壁后放置培养箱分别培养24、48、72、96 h，每组设5个复孔，同时设置空白调零组(不加细胞，加入等量的PBS)。培养结束前1 h，各孔加入CCK- 8溶液0.01 ml后继续培养1 h，选择酶标仪波长为490 nm，测量吸光度值(A490)。细胞存活率=(实验组A490值-空白调零组A490值)/(对照组A490值-空白调零组A490值)×100%。

流式细胞术检测细胞凋亡收集转染后培养24 h的MHCC97H细胞，按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，先加入5 μl AnnexinV-FITC混匀后，再加入5 μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)，在室温下避光反应15 min，立即用流式细胞仪进行检测。

流式细胞术检测细胞周期将各组细胞制备成单细胞悬液，按照细胞周期检测试剂盒说明书进行操作，细胞经PBS洗涤后先加入10 μg/ml的RNaseA，37 ℃下作用30 min后再加入10 μg/ml的PI，在室温下避光反应30 min，用流式细胞仪检测后用Modifit软件分析各组细胞的周期分布。

Western blot法检测蛋白表达收集转染miR- 132的MHCC97H细胞，裂解细胞并分离细胞蛋白质，用Bradford法测量蛋白浓度后取等量蛋白质样品(20 μg/孔)，常规8% SDS-PAGE电泳，半干转膜仪转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入特异性一抗(1∶1000)于4 ℃下孵育过夜，HRP标记的羊抗兔IgG为第二抗体(1∶2500)室温孵育1 h，ECL显色，条带曝光强度用Quantity One 4.6.2(BIO，RAD)软件分析，以β-actin为内参，通过与内参的灰度比，得出目的条带的相对表达水平。

miR- 132对裸鼠肝癌皮下移植瘤的影响取对数生长期的空白对照组、阴性对照组和转染组MHCC97H细胞，用无血清的RPMI- 1640培养基调整细胞密度为2×107个/ml，分别注射于裸鼠左侧大腿背部皮下，每只注射0.2 ml，每组5只，实验第4周时处死裸鼠，剥离裸鼠皮下肿瘤标本后称重。

TUNEL法检测皮下移植瘤细胞凋亡每组标本按TUNEL试剂盒说明书操作，TUNEL染色阳性细胞判定标准为胞浆不着色，胞核染成棕褐色，核固缩，染色质凝集成块或边集者，每个视野计数200个细胞，计数5个视野，凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

免疫组织化学法检测Ki- 67、Caspase 3和Survivin的表达按照Envision法的操作步骤进行免疫组织化学实验，每组标本经正常羊血清封闭非特异性抗原，加入一抗孵育过夜后，加入生物素标记的二抗，DAB显色，苏木精复染，脱水后封片。低倍镜(×100)下随机选择20个视野，图片结果用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件分析Ki- 67、Caspase 3和Survivin的阳性表达强度。

统计学处理采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示，正态分布变量多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

miR- 132在肝癌组织和癌旁正常组织中表达实时荧光定量PCR结果表明，在45例肝癌及对应的癌旁正常组织手术标本中，miR- 132的相对表达量分别为0.34±0.05和0.91±0.24，差异有统计学意义(P<0.05)。

各组MHCC97H细胞中miR- 132的表达MHCC97H细胞经转染CyTM3标记miRNA- 132 mimic后，绿色荧光激发转染成功的细胞中的CyTM3发射出红光，在倒置荧光显微镜下观察，在MHCC97H细胞内可见大量颗粒状荧光(图1)。RT-qPCR结果表明，在空白对照组、阴性对照组和转染组中miRNA- 132的相对表达量分别为0.84±0.13、0.92±0.15和3.45±0.67，转染组中miRNA- 132的表达较空白对照组和阴性对照组显著上调(P均<0.05)，空白对照组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

各组MHCC97H细胞增殖情况CCK- 8检测结果表明，自48 h起，转染组细胞存活率明显低于空白对照组或阴性对照组(P均<0.05)，在第96 小时，转染组细胞存活率最低，为51.4%(图2)。

各组MHCC97H细胞凋亡情况和细胞周期分析结果流式细胞检测结果显示，空白对照组和阴性对照组的细胞凋亡率分别为(8.2±1.8)%和(9.6±1.7)%，均明显低于转染组细胞的(18.7±4.4)%(P均<0.05)(图3)。对细胞周期进行分析可知，与空白对照组和阴性对照组比较，转染组细胞中的G0/G1期细胞比例明显上升，S期细胞比例明显下降(P均<0.05)(表1)。

转染miR- 132后对MHCC97H细胞中Survivin、p-AKT和Caspase 3蛋白表达的影响Western blot检测结果显示，与空白对照组或阴性对照组相比，转染组中Survivin和p-AKT的表达显著下调，而Caspase 3的表达明显上调，差异均有统计学意义(P均<0.05)(图4)。

转染miR- 132后对裸鼠肝癌皮下移植瘤生长的影响肿瘤细胞接种裸鼠皮下4 d后即可触及皮下肿瘤，成瘤率为100%，饲养至第4周，实验动物均未出现死亡。实验结束后剥离裸鼠皮下移植瘤组织后称重，转染组裸鼠肿瘤重量为(0.14±0.02)g，明显低于空白对照组的(0.57±0.18)g和阴性对照组的(0.52±0.11)g(P均<0.05)。

转染miR- 132对裸鼠肝癌皮下移植细胞凋亡的影响TUNEL检测结果表明，各组均可见凋亡细胞，转染组细胞凋亡指数为(21.6±4.8)%，明显高于空白对照组的(3.2±0.8)%和阴性对照组的(4.4±0.7)%(P均<0.05)(图5)。

图 1荧光显微镜下观察CyTM3标记miRNA- 132 mimic转染MHCC97H细胞后的效果(×100)

Fig 1Fluorescence microscopy of MHCC97H cells transfected with CyTM3-labelled miRNA- 132 mimic(×100)

与转染组比较，aP<0.05

aP<0.05 compared with transfection group

图 2CCK- 8法检测转染miR- 132对MHCC97H细胞增殖的影响

Fig 2Effect of the transfection of miR- 132 on cell viability in MHCC97H cells

A.空白对照组；B.阴性对照组；C.转染组

A. blank control group；B. negative control group；C.transfection group

图 3流式细胞术检测转染miR- 132后对MHCC97H细胞凋亡的影响

Fig 3Apoptosis of MHCC97H cells after transfection of miR- 132(analyzed using Annexin V-FITC/Propidium iodide flow cytometry)

表 1　转染miR- 132后对MHCC97H细胞周期的影响(n=5，x-±s，%)

与转染组比较，aP<0.05

aP<0.05 compared with transfection group

转染miR- 132对裸鼠皮下移植瘤细胞Ki- 67、Survivin和Caspase 3表达的影响免疫组织化学染色结果表明，空白对照组和阴性对照组中Ki- 67和Survivin阳性表达强度较高，而Caspase 3阳性表达强度较低；转染组肿瘤细胞中Ki- 67和Survivin的阳性表达强度均明显低于空白对照组和阴性对照组，另外Caspase 3的阳性表达强度显著增加，差异有统计学意义(P均<0.05)(图6)。

讨论

肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，全球癌死亡率排第3位，预后差，死亡率高，严重危害人类的健康和生命[4]。目前肝癌治疗的方法主要是手术治疗，而外科手术对早期实体瘤的患者较为有效，对复发、晚期及微小病灶的患者则达不到根治的目的，因此目前临床上需要一种新的肝癌早期诊断和治疗的分子标志，以期改善患者预后。miRNAs是一类非编码小分子RNA，可通过特异性识别靶基因mRNA的3’端非编码区位点而抑制蛋白翻译或诱导mRNA的降解，从而在转录后水平调控基因表达[1]。近年研究表明，miRNAs与恶性肿瘤的发生发展过程关系密切，其中miR- 132是目前比较公认的抑癌性miRNA，miR- 132已被发现在结肠癌、胰腺癌和肺癌等多种恶性肿瘤中表达降低[2- 3，5]。miR- 132主要是通过调控靶基因从而发挥抗肿瘤的作用，目前发现的几十种miR- 132靶基因中，大多数已经被证实可直接调控肿瘤恶性生物学行为，例如PDCD4基因可抑制细胞增殖，ZEB2基因可抑制细胞侵袭和转移等[3，5]。因此，miRNAs有望成为恶性肿瘤诊断、治疗及预后评估中新的分子靶点，但miR- 132在肝癌中的表达及作用机制尚未见报道。为此，本研究比较了miR- 132在45例肝癌组织及癌旁正常组织标本中的表达差异，结果表明，miR- 132在肝癌组织中的表达明显降低，提示miR- 132与肝癌的发展过程关系密切。

1：空白对照组；2：阴性对照组；3：转染组

1：blank control group；2：negative control group；3：transfection group

图 4Western blot法检测转染miR- 132后对肝癌MHCC97H细胞中Survivin、p-AKT和Caspase 3蛋白表达的影响，以β-actin 及AKT为内参

Fig 4Western blot analysis of expressions of Survivin，p-AKT，and Caspase 3 in MHCC97H cells after transfection of miR- 132， Western blotting for β-actin and AKT were performed as loading control representative

A.空白对照组；B.阴性对照组；C.转染组

A. blank control group；B. negative control group；C.transfection group

图 5TUNEL法检测各组裸鼠肝癌皮下移植瘤细胞凋亡(×400)

Fig 5Immunohistochemistry for apoptosis in each tumor tissue sections(by TUNEL method)(×400)

图 6免疫组织化学检测转染miR- 132后对裸鼠肝癌皮下移植瘤细胞中Ki- 67、Survivin和Caspase 3表达的影响(×400)

Fig 6Immunohistochemical analysis of the expressions of Ki- 67，Survivin，and Caspase 3 protein in harvested tumors from tumor-bearing mice after transfection of miR- 132(×400)

癌症的发生是多基因和多因素共同参与的细胞增殖、分化以及凋亡异常的过程，而肿瘤细胞凋亡异常与恶性肿瘤的关系最为密切。在以往研究中，miR- 132被证实能抑制恶性肿瘤生长，并诱导细胞凋亡[6- 7]，但目前尚未有miR- 132对体内肿瘤细胞作用的研究报道。为进一步研究miR- 132在肝癌细胞生物行为中的作用，本研究通过转染CyTM3标记miRNA- 132 mimic至肝癌MHCC97H细胞后，在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光激发转染成功的细胞中的CyTM3发射出红光，同时转染组细胞中miRNA- 132的表达显著上调，表明传染细胞miRNA- 132成功。为了分析转染miRNA- 132后对MHCC97H细胞增殖和凋亡的影响，在体外实验中，转染miRNA- 132后对MHCC97H细胞增殖有抑制作用，对细胞周期进行分析可知转染miRNA- 132后MHCC97H细胞G0/G1期细胞比例上升，S期细胞比例下降，细胞分裂主要被阻滞在G1期，而不能进入S期，与细胞増殖实验结果相吻合。同时流式细胞术结果表明，转染miR- 132后对体外肝癌MHCC97H细胞有凋亡诱导作用。在体内实验中，笔者建立起人肝癌皮下移植瘤模型，进行miR- 132抗体内肝癌作用的研究，结果表明转染miR- 132后肝癌皮下移植瘤重量较未转染组明显缩小，并且Ki- 67阳性表达强度明显降低，另外TUNEL实验结果表明转染组中凋亡肝癌细胞明显增加，体内实验结果与体外实验结果相一致，进一步表明miR- 132在调控肝癌细胞増殖、分化、细胞周期及凋亡等生理过程中发挥了重要作用。

AKT作为miR- 132调控的靶基因[8- 9]，激活后可影响下游多种效应分子，从而在恶性肿瘤的发生和发展、促进肿瘤细胞侵袭和转移以及肿瘤的免疫逃逸等多种恶性生物学行为中发挥重要作用，而AKT的活化依赖于其上游分子PDK来完成苏氨酸磷酸化位点(Thr308)和丝氨酸磷酸化位点(Ser473)的磷酸化，p-AKT可作用于其下游分子从而促进细胞增殖和保护细胞免于凋亡[10]。目前细胞凋亡过程有死亡配体通路和线粒体通路两条凋亡途径，而Caspase 3作为细胞凋亡的中心控制和效应阶段的终末效应酶，其活化可直接或间接引起细胞凋亡结构特征的出现[11- 12]。Survivin作为PI- 3K/AKT通路中的下游因子[13]，可抑制线粒体通路中细胞色素C的释放从而抑制凋亡效应分子Caspase 3的活化，进而阻断细胞凋亡[14]；同时Survivin还可促进肝癌细胞转化[15]。另外有报道指出，在肝癌细胞中，Ki- 67的阳性表达与Survivin的阳性表达间呈正相关关系[16]。本研究中，Caspase 3在体内外肝癌细胞中呈低表达，而Survivin和p-AKT呈高表达，转染 miR- 132后不仅可下调体外肝癌细胞中Survivin和p-AKT的表达，还可上调Caspase 3的表达，体内实验结果与体外实验结果相符，表明miR- 132可调控靶基因AKT及其下游因子Caspase 3和Survivin，从而在miR- 132抑制肝癌生长和诱导细胞凋亡中发挥一定作用。

综上，本研究结果显示，转染miR- 132后不仅可显著抑制体内外肝癌细胞生长，还能有效诱导体内外肝癌细胞凋亡，其作用机制可能为miR- 132通过调控靶基因AKT，影响下游因子Caspase 3和Survivin等凋亡相关蛋白的表达，为临床肝癌基因治疗提供一个新的作用靶点，但仍需进一步深入研究miR- 132抗癌效应的具体机制。

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·论著·

Effects of MicroRNA- 132 Transfection on the Proliferation and Apoptosis of Human Liver Cancer Cells in vitro and in vivo

LIU Hai-bin，HUA Ying，JIN Zhou-xiang

Department of Hepatic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，

Wenzhou，Zhejiang 325000，China

Corresponding author：LIU Hai-binTel：0577- 88002710，E-mail：liuhaibin2014@126.com

ABSTRACT：ObjectiveTo observe the biological role and underlying mechanism of microRNA-132 (miR- 132) in liver cancer cell proliferation and apoptosis. MethodsThe expressions of miR- 132 in the cancer tissue and their adjacent tissues from 45 liver cancer patients were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR). The biological effects of miR- 132 transfection on human liver cancer MHCC97H cells were assessed by CCK- 8 assay，flow cytometry，in vivo experiment in nude mice，and TUNEL test. Western blotting was used to detect the expressions of p-AKT，Survivin，and Caspase 3 in liver cancer cells. Immunohistochemistry was used to detect the positive expressions of Ki- 67，Survivin，and Caspase 3 in the xenograft tumors. ResultsThe expression level of miR- 132 was found to be down-regulated in liver cancer tissues compared with the matched adjacent tissues (P<0.05). After transfection，the expression of miR- 132 was significantly higher than blank control group and negative control group(P<0.05). The proliferation of liver cancer cells was inhibited significantly by miR- 132 transfection(P<0.05). Transfection of miR- 132 arrested cells in the G0/G1phase and triggered apoptosis of MHCC97H cells(P<0.05). After miR- 132 transfection，the expression of Caspase 3 was up-regulated，whereas the expressions of p-AKT and Survivin were down-regulated(P<0.05).In addition，the tumor weight in miR- 132 transfection group was significantly decreased in comparison with blank control group and negative control group(P<0.05). Apoptosis occurred more frequently in the miR- 132 transfection group than in control groups(P<0.05). Compared with the blank control group and negative control group，the miR- 132 transfection group had significantly decreased expression of Survivin but increased positive expression of Ki- 67 and Caspase 3(P<0.05). ConclusionsmiR- 132 is down-regulated in human liver cancer tissues. miR- 132 transfection can effectively inhibit proliferation and promote apoptosis of MHCC97H cells in vitro and in vivo. Therefore，miR- 132 may become a new target in liver cancer treatment.

Key words：liver cancer；microRNA- 132；apoptosis

收稿日期：(2014- 07- 22)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.01.006

中图分类号:R735.7

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2015)01- 0030- 07

通信作者：刘海斌电话：0577- 88002710，电子邮件：liuhaibin2014@126.com