不同温度下哈维氏弧菌和白斑综合症病毒对凡纳滨对虾的致病性

向赟，吴宇学，王刚，陈兆明，张锐，孙成波、3

(1．广东海洋大学水产学院，广东湛江524025;2．广东海洋大学实验教学部，广东湛江524025;3．广东高校热带海产无脊椎动物养殖工程技术研究中心，广东湛江524025)

凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei为世界主要人工养殖对虾品种之一［1］，其养殖业已受到多种细菌病和病毒病的威胁，其中白斑综合症病毒作为一种对虾高致死性病毒，传染性强，宿主广泛，危害极大［2］。白斑综合症暴发的原因不仅与虾体免疫水平、感染方式、病毒数量、环境因子有关［3-4］，而且还与其他病原体有关，如副溶血弧菌、哈维氏弧菌等。其中哈维氏弧菌属革兰氏阴性，呈弧状，极生单鞭毛，广泛分布于近岸温暖海洋环境中，能感染多种海洋无脊椎和脊椎动物［5］，主要感染苗期及幼体的动物，如哈维氏弧菌会引起中国对虾及凡纳滨对虾幼体发病死亡［6-7］，也会引起成虾发病死亡。陈月忠等［8］报道，哈维氏弧菌会引起长毛对虾、日本对虾成虾发病死亡，严重制约了全球对虾养殖业的发展。本研究中，对携带白斑综合症病毒 (WSSV)的凡纳滨对虾在不同温度条件下注射感染不同浓度的哈维氏弧菌，探讨哈维氏弧菌对感染WSSV的凡纳滨对虾的影响，旨在为对虾养殖业健康可持续发展提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

健康凡纳滨对虾取自广东海洋大学东海岛海洋生物研究基地，体长为 (8．12±0．83)cm。

试验用哈维氏弧菌Vibrio harveyi由西北农林科技大学刘小林教授提供。

1.2 方法

试验前将凡纳滨对虾暂养5 d，每日投喂对虾人工配合饵料2次，换水1次，日换水量接近100%。试验前随机抽取10尾对虾进行荧光定量PCR检测，检测结果为阴性。

1．2．1 WSSV粗提液的制备 取感染WSSV症状明显的凡纳滨对虾，去除甲壳，按1∶1(g∶mL)加入高盐PBS，冰浴中匀浆，将匀浆液于4℃下以7000 r/min离心15 min;离心后的上清液加入蔗糖至终浓度为30%(质量分数)，4℃下以16 000 r/min超速离心 50 min，弃上清，沉淀用 PBS(pH 7．4)重悬，将重悬液用 0．22 μm 的滤膜过滤，分装后于冰箱 (-80℃)中保存备用。

1．2．2 菌悬液的制备 将哈维氏弧菌经接种、活化培养24 h后，用无菌PBS缓冲液稀释，制成菌悬液。

1．2．3 DNA模板提取和引物设计 参照Sun等［9］的方法提取DNA模板，参照You等［10］的方法设计PCR引物，并由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。

1．2．4 标准品的制备 参照程晓燕等［11］的方法制备重组质粒标准品，用核酸分析仪测定重组质粒的DNA浓度，根据下式计算重组质粒的拷贝数:

其中:阿伏加德罗常数为6．02×1023;重组质粒分子量=1个碱基对的平均分子量 (660 g/mol)×重组质粒的总长度 (bp)。

1．2．5 不同温度条件下哈维氏弧菌和WSSV对凡纳滨对虾的致病性试验 采用人工注射感染，在凡纳滨对虾第2腹节与第3腹肌之间往心脏方向注射40 μL病原缓冲液。

将试验对虾放入盛有60 L水的0．1 m3塑料桶中，分别在温度为(19±1)、(25±1)、(31±1)℃下进行培养。试验设继发感染组、单独感染组和对照组，各组均设3个平行，每个平行放对虾30尾。其中，继发感染组先注射 40 μL含 1．0×103copy/μL WSSV病毒粗提液稀释液，一天后再分别注射 40 μL 浓 度 为 1．1 × 105、1．1 × 104、1．1 ×103cfu/mL的哈维氏弧菌菌悬液，分别记为W+V高、W+V中、W+V低组;单独感染组单独注射40 μL 含1．0×103copy/μL WSSV 病毒粗提液稀释液和单独注射浓度为1．1× 105、1．1 × 104、1．1 ×103cfu/mL的哈维氏弧菌菌悬液，分别记为 W、V高、V中、V低组;对照组注射40 μL PBS缓冲液。试验过程中，每日投喂对虾人工配合饵料2次，24 h充气，定时吸出排泄物，日换水量为20%。及时捞出死亡对虾放入冰箱 (-20℃)中保存。各组在感染后0、6、12、24、48、72、96 h取样保存。观察记录对虾发病及死亡情况，定期检测对虾组织中的病毒含量，并对死亡对虾进行病毒检测。

1．2．6 病毒的检测 采用荧光定量PCR方法并参考程晓燕等［11］的方法检测病毒的含量。

2 结果与分析

2.1 (19±1)℃水温下感染哈维氏弧菌对携带WSSV的凡纳滨对虾的影响

2．1．1 凡纳滨对虾的死亡情况 从图1可见，温度为 (19±1)℃时，单独感染不同浓度的哈维氏弧菌和WSSV与继发感染两种病原对凡纳滨对虾的累积死亡率影响不大，至试验结束各组累积死亡率均低于8．9%。

图1 温度为 (19±1)℃条件下感染哈维氏弧菌和WSSV病毒凡纳滨对虾的累积死亡率Fig.1 Cumulative mortality of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei infected with Vibrio harveyi and WSSV at(19 ±1)℃

2．1．2 凡纳滨对虾的病毒携带量 从表1可见:温度为 (19±1)℃时，整个试验过程中，单独感染WSSV组对虾体内携带的病毒量在6 h时显著高于继发感染组 (P＜0．05);24、48 h时继发感染浓度为1．1×105cfu/mL组的病毒携带量明显高于其他组 (P＜0．05);72 h时各组病毒携带量均很高，最大值为3．9×104copy/g。

2.2 (25±1)℃水温下感染哈维氏弧菌对携带WSSV的凡纳滨对虾的影响

2．2．1 凡纳滨对虾的死亡情况 从图2可见:温度为 (25±1)℃时，0～24 h时各组的累积死亡率低于13．3%(P＞0．05);至48 h时继发感染浓度为1．1×105cfu/mL 组对虾累积死亡率 (34．3%)明显高于另外两个继发感染浓度组 (P＜0．05);至72 h时3个继发感染组和单独感染WSSV组对虾累积死亡率明显高于单独感染不同浓度细菌组，且单独感染WSSV组 (62．2%)和继发感染浓度1．1×105cfu/mL 组(65．7%)显著高于其他组(P＜0．05);至96 h时3个继发感染组和单独感染WSSV组的累积死亡率显著高于单独感染不同浓度的细菌组(P＜0．05)。

表1 温度为 (19±1)℃条件下感染不同浓度哈维氏弧菌对凡纳滨对虾病毒携带量的影响 (平均值±标准差)Tab.1 Effects of infected concentrations of Vibrio harveyi on amount of virus in Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei at(19±1)℃ (mean±S.D.)

图2 温度为 (25±1)℃条件下感染哈维氏弧菌和WSSV病毒凡纳滨对虾的累积死亡率Fig.2 Cumulative mortality of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei infected with Vibrio harveyi and WSSV at(25±1)℃

2．2．2 凡纳滨对虾的病毒携带量 从表2可见:温度为 (25±1)℃时，整个试验过程中，至48 h时单独感染WSSV组对虾体内携带WSSV的病毒量显著高于3个继发感染组 (P＜0．05);72 h时单独感染WSSV组对虾体内携带病毒量显著低于3个继发感染组 (P＜0．05);96 h时继发感染浓度1．1×105cfu/mL组的病毒携带量明显高于其他组 (P＜0．05)。

2.3 (31±1)℃水温下感染哈维氏弧菌对携带WSSV的凡纳滨对虾的影响

2．3．1 凡纳滨对虾的死亡情况 从图3可见:温度为 (31±1)℃时，0～24 h时各组对虾的累积死亡率低于12．0%(P＞0．05);至48 h时单独感染WSSV组的累积死亡率显著低于继发感染浓度1．1×103、1．1×105cfu/mL 组 (P＜0．05);至 72 h时单独感染WSSV组累积死亡率 (42．3%)明显高于单独感染细菌组 (P＜0．05)，但明显低于3个继发感染组 (P＜0．05)，而继发感染浓度1．1×105cfu/mL组的累积死亡率最大，为80．0%。

图3 温度为 (31±1)℃条件下感染哈维氏弧菌和WSSV病毒凡纳滨对虾的累积死亡率Fig.3 Cumulative mortality of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei infected with Vibrio harveyi and WSSV at(31±1)℃

2．3．2 凡纳滨对虾的病毒携带量 从表3可见:温度为 (31±1)℃时，整个试验过程中，6 h时继发感染浓度1．1×105cfu/mL组与其他组存在显著性差异 (P＜0．05);12 h时单独感染WSSV组病毒携带量显著低于浓度为 1．1×105、1．1×104cfu/mL的2个继发感染组 (P＜0．05)，随着细菌浓度的增加病毒携带量也增加;24 h时病毒开始加快增殖，继发感染浓度1．1×105cfu/mL、1．1×104cfu/mL 组明显高于另两组 (P＜0．05);48～72 h时各组病毒携带量均很高;72、96 h时单独感染WSSV组显著低于继发感染组 (P＜0．05)。

表2 温度为 (25±1)℃条件下感染不同浓度哈维氏弧菌对凡纳滨对虾病毒携带量的影响 (平均值±标准差)Tab.2 Effects of different concentrations of Vibrio harveyi on amount of virus in infected Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei at(25±1)℃ (mean±S.D.)

表3 温度为 (31±1)℃条件下感染不同浓度哈维氏弧菌对凡纳滨对虾病毒携带量的影响 (平均值±标准差)Tab.3 Effects of different concentrations of Vibrio harveyi on amount of virus in infected Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei at(31±1)℃ (mean±S.D.)

3 讨论

温度作为最重要的环境因子之一，不仅直接影响对虾的新陈代谢、抗病能力、进食、生存发育，而且还对病毒在对虾体内增殖有重要影响。李侃等［12］报道，病毒在温度为21～30℃时增殖最快，而当温度低于20℃或超过30℃时，病毒的增殖速度受到部分抑制。Du等［13］报道，虾体内病毒携带量在低温 (10±1)℃条件下明显低于 (24±1)℃条件下，说明低温可以抑制WSSV在虾体内增殖。Jira等［14］报道，将感染WSSV的垂死小龙虾从22℃水温转移至16℃水温，可以延缓小龙虾的死亡，说明低温可以降低WSSV对小龙虾的致病性。Rahman等［15］报道，在对虾感染WSSV前期，高温33℃可以延缓疾病暴发，有效降低对虾死亡率，抑制WSSV在对虾体内增殖;Du等［16］通过试验也证明，高温 (33℃)可以延长病虾存活时间。Sudha等［17］将WSSV与对虾的关系分为3种:第一种为前期急性感染，机体高度感染WSSV，2～3 d时大面积死亡;第二种为急性和亚急性感染，机体中度或高度感染WSSV，7～10 d时出现高死亡率;第三种为慢性感染 (潜伏感染)，机体轻微感染，15～28 d时出现死亡。虾体感染细菌后会打破细胞内水与离子含量平衡，促使细胞肿大，破坏细胞氧化酶系统，供能不足，引起物质代谢障碍和细胞功能下降［18］，导致抗病能力下降，易引起二次感染。

本研究结果表明，在温度为 (19±1)℃条件下，各组累积死亡率都很低，低于8．9%。病毒携带量检测结果中也发现，随着时间的延长，继发感染组病毒含量有一个升高趋势，之后有下降波动，而单独感染病毒组则没有，各组的病毒含量均低于3．9×104copy/g，低于简旭凤［19］报道的对虾濒死时病毒携带临界值1．0×105copy/g，因此，感染WSSV未出现大量对虾死亡。哈维氏弧菌单独感染组中各浓度组同样未出现大量死亡，说明在低温条件下，两种病原体处于潜伏感染期。管越强［20］报道，水温处于低温 (15℃)对日本对虾体内WSSV的增殖有抑制作用。钟硕良等［21］报道，当水温高于32℃或低于28℃时，哈维氏弧菌生长速度降低，仔虾累积死亡率也随之降低。本试验中也证实，在温度 (19±1)℃下，不仅WSSV在凡纳滨对虾体内的增殖受到抑制，而且哈维氏弧菌在对虾体内的生长也受到影响。

在温度 (25±1)℃条件下，感染哈维氏弧菌后0～24 h，细菌最高浓度继发感染组累积死亡率比其他组高，但各组均低于13．4%;至24 h时继发感染组病毒携带量均低于5．2×103copy/g，但病毒携带量高于单独感染WSSV组;48 h后不同浓度继发感染组和单独感染组之间出现显著差异，单独感染WSSV组的对虾累积死亡率与最高浓度继发感染组相似，继发感染组的累积死亡率随细菌感染浓度的增加而升高，但单独感染WSSV组的死亡率明显高于另外两个浓度继发感染组的结果与丁燏等［22］报道的继发感染累积死亡率要比单独感染高的结果不相符，可能是因为试验温度条件不同所致。目前研究较多的是哈维氏弧菌对凡纳滨对虾仔虾、日本对虾成虾致病性的研究，在低于28℃条件下哈维氏弧菌对凡纳滨对虾成虾的致病性有待进一步研究。至48 h时单独感染WSSV组病毒携带量比继发感染组高，但至72 h时继发感染组病毒携带量迅速增加，明显高于单独感染组。说明随着时间的延长，哈维氏弧菌对对虾组织引起损伤，对虾抗病力下降，为WSSV增殖提供了条件。

在温度 (31±1)℃条件下，感染哈维氏弧菌后0～24 h，各组的累积死亡率低于12．0%，病毒携带量都低于2．3×103copy/g;48 h后继发感染组累积死亡率明显高于独感染组，而且病毒携带量随着细菌感染浓度的升高而增加。单独感染WSSV组累积死亡率和病毒携带量的研究结果说明，在温度为(31±1)℃条件下可以减缓WSSV的增殖，推迟了白斑综合症暴发的时间。此结果与Vidal等［23］报道的在高温 (32．3±0．8)℃ 条件下可推迟携带WSSV凡纳滨对虾暴发白斑综合症的结果相符。继发感染组累积死亡率和病毒携带量的研究结果也证实了钟硕良等［21］报道的在 (31±1)℃条件下有利于哈维氏弧菌生长的结论。先感染WSSV的对虾机体已有损伤，抗病能力下降，更加有利于哈维氏弧菌的侵染，随着细菌数量的增多，对虾抗病能力下降更快，加快WSSV在对虾体内增殖，从而加速对虾死亡。陈细法等［24］认为，携带病毒的对虾生长在良好养殖环境中，可处于潜伏感染期，但由于抗病能力下降会因外在胁迫因子变化引发病毒病。所以，给对虾注射感染细菌后，细菌随血淋巴循环扩散至全身，引起细菌大量繁殖，会加快疾病的发生。

综上，哈维氏弧菌和WSSV两种病原体在低温(19±1)℃条件下，致病力都较低，可能是低温条件不利于病原体在机体内增殖;在温度 (25±1)℃条件下，WSSV对对虾的致病力高于哈维氏弧菌的致病力;在温度为 (31±1)℃条件下，单独感染WSSV时，WSSV的致病力受到一定抑制，随着时间的延长，哈维氏弧菌致病力在感染后期引起WSSV致病力提高，使WSSV在对虾体内增殖加快。因此，温度调控对于对虾养殖中的病害预防有重要意义。

［1］王兴强，马甡，董双林．凡纳滨对虾生物学及养殖生态学研究进展［J］．海洋湖沼通报，2005(4):94-100．

［2］Flegel T W．Current status of viral diseases in Asian shrimp aquaculture［C］．Israeli Journal of Aquaculture Bamidgeh，2009:229-239．

［3］吴信忠．中国海洋病害学主流研究的进展［J］．太平洋学报，2005，10:49-59．

［4］孙成波，何建国，黎子兰，等．凡纳滨对虾和斑节对虾对 WSSV敏感性的比较［J］．湛江海洋大学学报，2006，26(3):17-20．

［5］Ramesh A，Venugopalan V．Response of enteric luminous bacteria to environmental conditions in the gut of the fish［J］．Journal of Applied Bacteriology，1989，66(6):529-533．

［6］刘问，钱冬，杨国梁，等．南美白对虾虾苗淡化期间发光病病原研究［J］．集美大学学报:自然科学版，2005，9(4):300-304．

［7］Vandenberghe J，Li Y，Verdonck L，et al．Vibrios associated with Penaeus chinensis(Crustacea:Decapoda)larvae in Chinese shrimp hatcheries［J］．Aquaculture，1998，169(1):121-132．

［8］陈月忠，钟硕良，周宸．成虾发光病病原体的分离鉴定及防治技术研究［J］．中山大学学报:自然科学版，2000，39:218-223．

［9］Sun Y，Li F，Xiang J．Analysis on the dynamic changes of the amount of WSSV in Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis during infection［J］．Aquaculture，2013，376:124-132．

［10］You X X，Su Y Q，Mao Y，et al．Effect of high water temperature on mortality，immune response and viral replication of WSSV-infected Marsupenaeus japonicus juveniles and adults［J］．Aquaculture，2010，305(1):133-137．

［11］程晓艳，刘庆慧，黄倢．实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合症病毒方法的建立［J］．安徽农业科学，2010(2):14265-14267．

［12］李侃，罗淑娅，徐丽美．温度影响对虾白斑综合症病毒增殖机制的研究［J］．应用海洋学学报，2013(1):61-66．

［13］Du H，Dai W，Han X，et al．Effect of low water temperature on viral replication of white spot syndrome virus in Procambarus clarkii［J］．Aquaculture，2008，277(3):149-151．

［14］Jira P，Söderhäll K，Söderhäll I．Effect of water temperature on the immune response and infectivity pattern of white spot syndrome virus(WSSV)in freshwater crayfish［J］．Fish ＆ Shellfish Immunology，2004，17(3):265-275．

［15］Rahman M M，Corteel M，Wille M，et al．The effect of raising water temperature to 33℃in Penaeus vannamei juveniles at different stages of infection with white spot syndrome virus(WSSV)［J］．Aquaculture，2007，272(1):240-245．

［16］Du H H，Li W F，Xu Z R，et al．Effect of hyperthermia on the replication of white spot syndrome virus(WSSV)in Procambarus clarkii［J］．Diseases of Aquatic Organisms，2006，71(2):175-178．

［17］Sudha P，Mohan C，Shankar K，et al．Relationship between white spot syndrome virus infection and clinical manifestation in Indian cultured penaeid shrimp［J］．Aquaculture，1998，167(1):95-101．

［18］黄琪琰．水产动物疾病学［M］．上海:上海科学技术出版社，1993．

［19］简旭凤．白斑综合症病毒(WSSV)原位PCR及定量PCR检测技术的建立［D］．广州:中山大学，2003．

［20］管越强．主要环境因子对养殖对虾抗病力及白斑综合症发生的影响［D］．北京:中国科学院研究生院，2003．

［21］钟硕良，陈月忠．环境因子对发光细菌的生长及日本对虾仔虾感染死亡率的影响［J］．中国水产科学，2001，8(1):41-45．

［22］丁燏，王雷．对虾病毒病暴发前期病毒和弧菌相互作用关系［J］．湛江海洋大学学报，2000，20(3):26-31．

［23］Vidal O M，Granja C B，Aranguren F，et al．A profound effect of hyperthermia on survival of Litopenaeus vannamei juveniles infected with white spot syndrome virus［J］．Journal of the World Aquaculture Society，2001，32(4):364-372．

［24］陈细法，吴定虎．对虾病毒病和细菌合并感染的病理特点和诊断价值［J］．病毒学报，1997，13(2):146-150．