猪圆环病毒2型与猪圆环病毒相关性系统疾病的回顾及展望

顾金燕，邢刚，雷静，刘斐，周继勇

猪圆环病毒2型 (Porcine circovirus type 2，PCV2) 是目前已知的最小的哺乳动物病毒，直径为12–23 nm，是猪圆环病毒相关性系统疾病(PCV2-systemic disease，PCV2-SD) 的主要病原。PCV2能损伤猪的免疫系统，以淋巴结肿大、淋巴细胞减少等为特征，导致严重的免疫抑制，给世界养猪业带来巨大的损失。近几年疫苗的使用使PCV2-SD得到了一定的控制[1]。

1 PCV2的进化历程

1974年，德国学者Tischer首次描述了一种存在于猪肾细胞系 PK15 (ATCC-CCL33) 的类似小核糖核酸病毒的细胞污染物[2]。8年后，他证明这种污染物是一种猪源的单链环状的DNA病毒，并命名为猪圆环病毒 (Porcine circovirus，PCV)[3]。将PCV接种猪后，对猪不具有致病性。1996年，加拿大学者首次描述了一种新的、从1991年开始偶发的猪病，该病主要侵犯5–12周龄的猪群且涉及猪病的多个器官的损伤，称之为断奶后仔猪多系统衰竭综合征 (PMWS)[4-5],现在国际上多称为 PCV2相关性系统疾病(PCV2-SD)。随后，该病在全世界相继被报道，逐渐受到人们关注，并从PCV2-SD患猪中分离到一种新的PCV，这种PCV能致病，且抗原性和核苷酸序列与之前分离到的无致病性的 PCV存在差异，为了区分两者，将不致病的PCV命名为 PCV1，能致 PCV2-SD的 PCV命名为PCV2。2009年，德国科学家利用原位杂交和PCR技术在一份保存于1962年的猪脾和肺脏组织中检测到了PCV2[6]，说明PCV2可能在猪群中存在已长达50年以上，在这50多年间，PCV逐渐从一种对猪群无害的病毒演变为能对猪群造成重大伤害的病毒。

PCV2主要有两种基因型：PCV2a和PCV2b。两者基因组长分别为1 767和1 768个核苷酸[7]，还有一种 PCV2c仅在丹麦有过报道[8]。起初 PCV2a的大流行导致大规模的亚临床感染与零星的发病，大约到20世纪90年代，PCV2b逐渐成为优势毒株并导致了PCV2-SD的大爆发，并且大多数在动物模型上成功诱导健康猪发病的基因亚型都为 PCV2b[9]。2010年，Guo等测定了2004至2008年间分离自我国各地多株 PCV2毒株的序列，并按照现行基因分型原则进行分析，首次提出了PCV2d亚型[10]。2011年，Jantafong等将在泰国分离到的一株新PCV2毒株命名为 PCV2e[11]，近两年，PCV2d和PCV2e在世界其他地区也偶见报道[12-13]。但是Cortey等并不同意这种新的亚型命名方式，他们认为应该坚持将 PCV2分为 a、b、c 三个亚型[14]。我们实验室对在 2009–2013年间从中国东部地区分离到的20株PCV2进行分析，发现两株PCV2虽然具有PCV2b标签序列，但在进化分析中却组成一个独立分支，可能是一个新的基因型，并命名为PCV2new[15]。除此之外，我国还分离到一些基因缺失毒株、基因插入毒株、重组毒株、类PCV毒株等圆环病毒的突变体[16]。总之，不管用哪种分类方式，以上研究都表明当前 PCV2的变异速度加快，且临床上存在多种PCV2亚型共感染，PCV2与其他多种病毒 (如猪瘟病毒、蓝耳病毒、细小病毒、伪狂犬病毒等) 共感染的现象，感染情况普遍且复杂。另有研究发现，PCV2现已不仅在猪群中流行，在人类、牛、啮齿动物、苍蝇、蚊子、贝类等动物种群以及水、人用疫苗、空气中也分别检测或分离到了PCV2[17-21]，为PCV2-SD的防控带来新的挑战。

2 PCV2编码蛋白

PCV2基因组很小，Hamel等通过软件分析认为其基因组结构存在11个潜在的开放阅读框(Open reading frame，ORF)。PCV2充分利用了其在宿主细胞内形成的复制中间体及阅读框间相互重叠的方式传达了大量的遗传信息[22]，其中ORF1、5、7和10位于病毒正链DNA上并顺时针转录，而ORF2、3、4、6、8、9、11则位于病毒负链DNA上并逆时针转录[23]，到目前为止，ORF1、2、3、4的编码产物已经被分别证明，其他阅读框所编码产物是否存在尚不清楚。

2.1 ORF1编码蛋白

ORF1基因，亦称rep基因，是PCV2基因组中最大的ORF (945 bp，nt 51-995)，在其基因启动子区存在一个干扰素刺激反应元件(ISRE，nt 1 737-1 751)，研究证明该ISRE在病毒的转录起始方面起着很重要的作用[24]。rep基因编码两个复制必需蛋白Rep和Rep’，前者编码自rep基因的全长转录本，而后者则由rep基因剪接转录本翻译而得，虽然两者的N端是一致的，但是由于 Rep’剪接造成的移码，两者 C端的氨基酸差异很大[25]。

之前大量实验数据证明，Rep及 Rep’蛋白主要定位于细胞核[26-27]，这可能与Rep及Rep’蛋白N端存在的核定位信号相关。Rep及Rep’蛋白的共同 N端存在 3个核定位信号区(NLS1、2、3)，其中 NLS1和 NLS2是 Rep及Rep’蛋白核定位所必需的，NLS3在蛋白核转运过程中起促进作用。但是我们实验室证实 Rep蛋白仅在病毒感染早期定位于核质，随着时间推移慢慢向细胞核周围移动并进入细胞质[28]。Finsterbusch等通过细菌双杂交系统发现了syncoilin蛋白和转录调节蛋白c-myc与Rep蛋白互作，随后有人用酵母双杂交系统又鉴定出了宿主细胞中能与 Rep蛋白互作的锌指蛋白265 (ZNF265)、胸腺嘧啶糖苷酶 (TDG) 和血管生成因子 VG5Q。有趣的是 Rep’只能与 VG5Q及 TDG发生反应，这可能是因为 Rep蛋白与ZNF265作用的位点位于两者差异很大的C端[29]。

2.2 ORF2编码蛋白

位于负链的 ORF2基因编码一个大小为27.8 kDa的衣壳蛋白Cap，Cap蛋白是PCV2的结构蛋白。随着Cap单体蛋白晶体结构的解析，人们终于解开了其组装方式的神秘面纱，在这个模型中，60个Cap蛋白亚基即可形成了一个对称的二十面体，独立构成完整的PCV2衣壳。

分子流行病学显示cap基因比其他ORF基因更容易发生变异，而且 cap基因的多态性与PCV2的毒力和复制能力相关。研究发现，Cap蛋白110位的脯氨酸变成丙氨酸 (P110A)、191位的精氨酸变成丝氨酸 (R191S) 后，PCV2在体外的生长能力增强但在体内的毒力衰减[30]。有学者在比较 PCV2a和 PCV2b差异序列时发现，Cap蛋白的190-191-206-210四个保守氨基酸残基与病毒蛋白的分布模式相关，PCV2b的这4个氨基酸残基AGIE比PCV2a的SRKD更有利于Cap和Rep蛋白在细胞核中的定位，从而促进了病毒的复制[31]。我们实验室分离到的长度为1 766 bp的PCV2毒株与1 767 bp毒株相比，其cap基因中1 059处碱基缺失，导致体外复制能力增强[32]。为了解 PCV2新的潜在单核苷酸缺失可行性，本实验室选择 Cap蛋白抗原表位外不影响 ORF2内其他编码框翻译的1 376、1 377、1 378和1 379位点的碱基进行单核苷酸缺失感染性克隆构建，结果显示，1 376位点不是 PCV2形成病毒粒子所必需的，但是它的缺失能增强病毒复制能力，促进IL-6的表达[33]，再次说明Cap蛋白与PCV2的复制能力相关。

作为主要的免疫原性蛋白，Cap蛋白的抗原表位逐渐被解析，2000年，Mahé等利用PEPSCAN技术鉴定出了Cap蛋白的4个线性表位，分别为 aa65-87、aa117-131、aa157-183和aa193-207[34]；2004年，Lekcharoensuk等利用PCV1和 PCV2嵌合病毒鉴定出了由 aa47-63、aa165-200和C末端的最后4个氨基酸共同构成的至少3个构象表位[35]。2009年，我们利用单抗及合成肽精细地定位了 Cap蛋白的aa156-162、aa175-192、aa195-202和aa231-233四个线性表位, 其中aa231-233既是线性表位又能形成构象表位，并确认其是潜在的 PCV2感染的血清学标志[32]。2011年，Guo等在Cap蛋白的核定位信号区鉴定出了一个新的抗原表位aa26-36，对Cap蛋白的核定位和功能研究有重要意义[36]。2013年，Ge等利用噬菌体展示技术又发现了aa86-93和aa102-107两个抗原表位。aa86-93是Cap蛋白中PCV2a和PCV2b两个基因型间差异最明显的氨基酸序列，可能是区别PCV2两种基因型的靶标片段及特异性表位。aa102-107与PCV2细胞受体硫酸乙酰肝素潜在的结合位点末端序列 aa98-103部分重叠，而PCV2是通过Cap蛋白与受体硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素 B的糖胺聚糖结合而完成入胞过程的[37]，所以针对此表位的单抗可能可以影响PCV2的吸附及入胞[38]。

在PCV感染的早期，Cap蛋白定位于核仁，而后进入核质，说明 Cap蛋白可在细胞不同区域之间穿梭，这与只定位于核质的 Rep蛋白不同[26]。在 PCV2与宿主细胞相互作用的研究过程中，研究人员迄今发现了11个能与Cap蛋白互作的宿主细胞蛋白，包括补体因子C1qB、细胞粘附分子 P-selectin、makorin环指蛋白 1(MKRN1)、受体蛋白补充组件的球状头部 C1q(gC1qR)、核小体组装蛋白1 (NAP1)、前列腺凋亡反应蛋白4 (Par-4)、核仁磷酸蛋白1 (NPM1)、热休克蛋白 40 (Hsp40)、细胞骨架蛋白α-tubulin、热休克蛋白70 (Hsp70)[29,39-40]和我们实验室最近发现的胞质动力蛋白 IC1亚基[41]。另有研究表明，Cap蛋白在体外能与 Rep蛋白互作，甚至Cap蛋白之间也能发生互作[42]，我们实验室最近研究发现 Rep蛋白和ORF3蛋白具有干扰 Cap蛋白诱导小鼠产生保护性免疫反应的能力[43]。

2.3 ORF3编码蛋白

ORF3叠加于ORF1中，但转录方向相反。PCV1和 PCV2的 ORF3序列大小不一样，在PCV1中为621 bp，在PCV2中只有315 bp。2005年，Liu等首次通过实验证明ORF3编码蛋白是PCV2复制非必需的，但是它能通过活化caspase-8和caspase-3通路来诱导细胞凋亡[44]。随后的研究表明，ORF3蛋白能与pPirh2特异性结合并导致 p53聚集从而诱发细胞调亡[45-46]。动物试验表明ORF3与PCV2的致病性相关[47-48]，且ORF3能提高病毒在体内外的散播[49]。但是，我们实验室构建的ORF3缺失PCV2感染性克隆未能在细胞上拯救出病毒，ORF3是否在PCV2的复制中发挥作用有待进一步实验[50]。最近，Choi等研究发现在 PCV2感染的早期阶段，ORF3蛋白能促进蛋白酶体降解RGS16并促使猪上皮细胞分泌 IL-6、IL-8等细胞因子，这提示ORF3蛋白可能与PCV2引起的慢性炎症反应有关[51]。

2.4 ORF4编码蛋白

ORF4基因完全叠加在ORF3基因中，且转录方向与 ORF3一致，我们实验室分别从蛋白和转录本水平验证了PCV2 ORF4基因的转录和表达，其转录本为180 bp，并证明ORF4不是PCV2在体内外复制所必需的，ORF4缺失PCV2能够诱发感染细胞更高水平的 caspase-3、8、9活性，提示ORF4蛋白与凋亡抑制相关，是PCV2致病性的负调控基因[52]。随后，Gao等用RACE技术确定了ORF4的全长mRNA为355 bp[53]，并验证了ORF4编码蛋白不是PCV2复制所必需的，但却在感染的早期阶段抑制病毒的复制，ORF4编码蛋白通过抑制ORF3的转录来抑制细胞凋亡作用[54]。

3 PCV2对免疫系统的影响

PCV2是PCV2-SD的主要诱因，PCV2-SD患猪的最主要特征是淋巴结损耗。研究表明，淋巴结损耗会影响 B细胞、T细胞和 NK细胞[55-57]，且PCV2-SD患猪的外周血中性粒细胞和淋巴细胞的相对比例与健康猪是相反的，说明 PCV2的感染会对宿主免疫系统产生巨大的影响[58]。

PCV2很容易侵犯宿主先天免疫系统的单核/巨噬细胞系统和树突状细胞，但是PCV2在巨噬细胞中复制非常缓慢，在树突状细胞中基本不复制，PCV2与这些细胞共存，不被降解，不被递呈，也不引起细胞凋亡，极有可能PCV2仅是利用这些细胞作为自己在宿主体内散播的载体，这可能与 PCV2的免疫逃避机制相关[27,59]。PCV2感染巨噬细胞后虽然不会引起细胞凋亡，但是会降低其杀微生物的能力。除此之外，感染 PCV2的肺泡巨噬细胞会产生高水平TNF-α和IL-8，同时上调中性粒细胞趋化因子Ⅱ、粒细胞集落刺激因子和单核细胞趋化蛋白1的水平[60]。

研究表明，PCV2感染能提高宿主淋巴组织和外周血单核细胞中 IL-10的表达水平[61]，IL-10能够抑制活化的T细胞产生细胞因子，抑制NK细胞活性，干扰NK细胞和巨噬细胞产生细胞因子。据报道病毒的持续感染或慢性感染会导致IL-10的高水平表达，IL-10表达水平的提高导致 IL-12等细胞因子分泌减少从而诱导免疫抑制，阻碍病毒清除[62]。PCV2感染中IL-10高水平的表达提示 IL-10诱导的免疫抑制在PCV2的致病和持续性感染中扮演重要角色[63]。Crisci等发现在PCV2-SD患猪的脾脏中，IL-10表达上调都位于 T细胞富集区，而很少位于 B细胞或巨噬细胞富集区，这有利于 IL-10对 T细胞的调节，诱导下游免疫抑制[64]。有趣的是，在感染 PCV2的细胞中并没有检测到高水平的IL-10，而在感染细胞周围的细胞中 IL-10的表达水平非常高，这可能是旁分泌作用导致的[63]。除了IL-10以外，PCV2还能诱导IL-1β和IL-8的产生，但是对 IL-2、IL-4和 IFN-γ的表达具有抑制作用，说明 PCV2的感染影响了患猪的免疫功能[61,65]。

在 PCV2感染猪体实验中，中和抗体一般在接种后4周产生[66]，中和抗体的水平与PCV2的复制相关。Meerts等发现，在中和抗体和IFN-γ水平很高的猪体中，PCV2的病毒载量很低；而在中和抗体和IFN-γ水平很低的猪体中，PCV2的病毒载量很高，提示中和抗体在清除宿主病毒中起着很重要的作用[67]。在PCV2-SD患猪体内往往不能产生特异性中和抗体或抗体水平很低，这可能导致病毒在体内大量积聚[68]，总之，体液免疫受损，特别是中和抗体反应的失能可能是导致PCV2-SD的重要原因。

淋巴细胞的活化是 PCV2在体内增殖所必需的，免疫刺激能促进 PCV2的增殖，这些现象说明 PCV2能利用天然免疫系统促进自身的增殖，但同时它又破坏宿主免疫系统，影响关键天然免疫细胞的功能，造成免疫抑制。PCV2究竟如何导致PCV2-SD的发生？哪些因子在这个过程中起着作用？淋巴系统的损伤又是如何造成的？解决这些问题并不容易，仍然需要科学家们进一步探索。

4 技术防控

4.1 诊断与检测技术

PCV2单独感染时常呈现亚临床感染状态，混合感染时又与其他共感染病原导致的临床症状及器官病变十分相似，仅依靠临床和病理学诊断很难准确检测该病。国内外学者对 PCV2的诊断与检测技术投入了大量的研究，并取得了很大的进步，这些技术大致可以分为病原学检测技术和血清学检测技术。

PCV2病原学检测技术主要有 PCR技术、原位杂交技术和核酸探针技术。PCR技术具有快速、简便、特异性强的优点，是实验室最常用的检测 PCV2病原的方法。随着分子生物学的发展，常规PCR和基于此的多重PCR、竞争PCR、荧光定量PCR等检测PCV2的PCR检测技术被不断建立。1999年，Larochelle等应用建立多重 PCR方法检测了加拿大地区 1994–1998年间的42份病料，此法成功鉴别了每份样品中PCV的型[69]。2000年，Liu等建立了检测感染仔猪样品中PCV基因的竞争PCR方法，此法不仅能够区分PCV1和PCV2，还能确定病毒的拷贝数量[70]。Mcintosh等建立了绿色荧光实时PCR方法来检测PCV2，运用该方法成功地从血清、粪便、肠系膜淋巴结、心肌层、肝脏、肾脏中检测出PCV2[71]。除此之外，基于PCR技术的环介导等温扩增技术(LAMP)操作简便，非常适合基层操作，我们实验室 Qiu等建立的LAMP方法能准确鉴别PCV2a和PCV2b，具有很好的特异性、灵敏性和稳定性[72]。2007年，Pérez-Martín等建立了检测病料中PCV2的原位杂交方法[73]，同年，国内姚鑫等利用原位杂交技术分析了 PCV2在人工感染仔猪主要组织中的分布，此法具有良好的敏感型与特异性，可用于 PCV2的实验室诊断和感染靶细胞的定位[74]。核酸探针技术是一种快速、可靠、敏感度高的检测 PCV2的方法，姜永厚等结合 PCR方法和DNA-DNA杂交技术建立的PCV2检测与分型寡核苷酸芯片可以准确鉴别PCV病毒基因型，其灵敏度是凝胶电泳的 5倍[75]。肖驰等根据PRRSV、CSFV、PCV2的序列制成相应探针并构建的DNA芯片具有特异性高、灵敏度高和可重复利用的优点，能够同时检测PRRSV、CSFV和PCV-2感染[76]。

血清学检测技术主要有间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay，IFA)、免疫过氧化物酶单层细胞试验 (Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)、酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和胶体金诊断方法等。1998年，Allan等建立了IFA方法用于PCV2感染猪的检测[77]。1998年，Ellis等建立了用于检测 PCV2感染猪的 IPMA方法[78]。2007年，刘长明等建立了用于检测PCV2血清抗体的IPMA[79]。ELISA检测方法具有快速、简单、敏感性高、特异性强又易于标准的优点，为最常用的血清学检测技术，用于检测抗体的ELISA有间接ELISA、竞争ELISA和阻断ELISA 3种。2000年，Walker等用细胞培养PCV2作为抗原，以PCV2单抗作为竞争抗体成功建立了检测PCV2抗体的竞争ELISA方法，结果显示此法比 IFA更敏感，具备大规模检测PCV2抗体的条件[80]。2002年，Nawagitgul等建立了分别基于PCV2病毒粒子和 Cap蛋白为抗原的间接ELISA方法检测PCV2抗体，结果显示两者的敏感性、特异性和准确性相似[81]。我们实验室 Shang等用大肠杆菌表达的核定位信号缺失 Cap蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法检测 PCV2抗体，研制出了我国第一个获得国家批准生产的商品化 PCV2 ELISA抗体检测试剂盒[82]。除了以上这些传统的PCV2检测技术，最近Hu等应用表面等离子共振技术检测液体样本中的 PCV2含量的方法[83]。Yang等进行了将 PCV2特异性的单域抗体融合于碱性磷酸酶作为新型的检测试剂的探索[84]。

4.2 免疫预防

控制病毒性疾病最好的方法是使用安全有效的疫苗。自2004年第一个PCV2疫苗在法国和德国生产使用以来，商品化的圆环病毒疫苗已在世界各地猪场广泛使用。亚单位疫苗、PCV1-2嵌合灭活苗和PCV2灭活苗等在欧洲、北美、韩国等地区都取得了很好的防疫效果。近年来，中国政府和养殖企业对PCV2-SD逐渐关注，我国浙江大学、华中农业大学、南京农业大学、哈尔滨兽医研究所等单位已成功开发出 5种全病毒灭活疫苗，这些疫苗为控制我国的PCV2-SD作出了重要贡献。与此同时，基于大肠杆菌、杆状病毒、伪狂犬病毒及腺病毒等载体的PCV2疫苗研究都取得了重要进展。Yin等在大肠杆菌表达系统获得了 Cap蛋白组装的病毒样颗粒[85-86]；Fan等在昆虫细胞中获得了Cap蛋白组装的病毒样颗粒，动物实验证明其能在小鼠体内诱导产生较好的免疫反应[87-88]。最新研究显示将poIFN-γ与cap基因在杆状病毒载体串联表达也能诱导小鼠体产生良好的免疫保护作用[89]。最近，武汉中博股份有限公司利用杆状病毒载体研发的 PCV2灭活疫苗取得了国家新兽药证书。除此以外，以伪狂犬病毒、腺病毒为载体的 PCV2疫苗试验也在不同的实验室进行[90-94]，这些研究为 PCV2基因工程疫苗的发展奠定了基础。

总之，虽然使用疫苗使PCV2-SD得到了一定程度的遏制，但由于 PCV2许多基本特性和致病机理不清，加上临床上 PCV2变异速度的加快、共感染问题愈加严重，未来PCV2-SD的防控面临着极大的挑战，因此，PCV2感染的研究与PCV2-SD新型控制技术的开发任重道远。

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