细菌内毒素的研究进展及其检查法的应用

张虞婷，丁苏苏，李倚云*

(1.扬州市食品药品检验检测中心，扬州 225009； 2.扬州市职业大学，扬州 225009)



细菌内毒素的研究进展及其检查法的应用

张虞婷1,2，丁苏苏1，李倚云1*

(1.扬州市食品药品检验检测中心，扬州 225009； 2.扬州市职业大学，扬州 225009)

本文通过查阅相关文献，分析和总结了细菌内毒素的起源、化学结构、生物活性及其毒性反应，就其检查法的应用进行了三点介绍。细菌内毒素在科学检验与研究中有重要意义，应进一步加强细菌内毒素及其检查法的研究，将其更好地应用于科学检验与研究。

细菌内毒素，鲎试剂，检查法

近年来，随着科学研究的深入，细菌内毒素在科学检验和研究中的应用越来越广泛。为了更好地了解和应用细菌内毒素，本文就细菌内毒素的研究进展及其检查法的应用进行综述。

1 细菌内毒素的研究进展

细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁外层上的特有成分，广泛分布于自然界中。通常革兰阴性菌细胞壁的外层由脂多糖(LPS)、外膜蛋白质、磷脂质以及金属离子所组成。一般细菌在正常状态下不释放细菌内毒素，只有当细菌死亡、自溶、繁殖或者黏附在其他细胞时，才表现出毒性[1]。

1.1 细菌内毒素的起源 1890 年，科学家在研究发热物质过程中，提出了细菌内毒素的概念。1933年，Boivin 等首次采用三氯醋酸自小鼠伤寒杆菌内提取出细菌内毒素，并进行免疫学的研究。因为其蛋白质反应呈现阴性，所以称其为脂多糖(LPS)。之后陆续有学者采用各种方法从不同的革兰阴性菌里提取出与 LPS 相似的物质，此物质有多种毒性反应。为了与外毒素区别，称之为内毒素[2]。1940 年，Morgan 使用志贺氏痢疾杆菌，阐明了细菌内毒素是一种由脂多糖、脂质及蛋白质三部分所组成的复合体[3]。到 20 世纪中期，随着免疫学、生物学、遗传学、物理化学等各类相关学科的进步和发展，细菌内毒素研究工作的深入，特别是其化学结构组成和各种生物活性间的关系方面，都更加明确起来。

1.2 细菌内毒素的化学结构 细菌内毒素是一种由 LPS、蛋白质和磷脂组成的复合物，分子量约1×106～20×106道尔顿。细菌内毒素与菌体细胞壁密切相连，其活性成分是 LPS，另外两个组成成分蛋白质和磷脂与其活性无关。LPS 也是一种结构多样的大分子复合物，有抗原性、毒性等特性。其由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(Lipid A)三个部分组成。

类脂 A 是 LPS 活性成分中不可缺少的部分，被视为 LPS 的“生物活性中心”，是抗原活性部位，保存着 LPS 的各种生物学活性。所以 Kasal 等认为游离类脂 A 也是一种内毒素[2]。类脂 A 位于最外层；多糖抗原向外，其由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，具有特异性；核心多糖分为内核心和外核心；外核心由数种己糖，包括葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖等组成；内核心含有庚糖及特殊的 KDO(3-脱氧-D-甘露醇-辛酮糖)，KDO 以不耐酸的酮糖键与类脂 A 的氨基葡萄糖连接，所有革兰阴性菌都有此结构。类脂 A 是以脂化的葡萄糖氨二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰阴性细菌内毒素的活性成分。类脂 A 具有免疫原性，注入动物体内可以产生相应抗体。类脂 A 的生物学活性主要在于其以酯键相连的脂肪酸，若其被水解，类脂 A 或 LPS 即失去活性[4，5]。

1.3 细菌内毒素的生物活性 类脂 A 作为内毒素生物活性的主要部分，也是近年来研究报道最多的。其是由氨基葡萄糖、磷酸及10～18个碳的长链脂肪酸组成。类脂A与可溶性的O-特异性链及核心分离后，会难溶于水。游离后的类脂 A ，自身可以凝聚成高分子复合体，复合体的分子量大小不等。同时，其还含有疏水性的中心及亲水性的边沿。这既是一种双相分子，又是酸碱两性分子。所以类脂 A 的独特结构使细菌内毒素具有多种生物活性[6,7]。

细菌内毒素的生物活性有很多，主要表现在如下几个方面[8，9]：① 肌体水平：致热性导致发热反应[10]、致死性毒性、体质量下降、白细胞和血小板减少、降低血压导致休克、激活凝血系统使血管内凝固、诱导对内毒素的耐受性和抗感染的特异性抵抗力。②细胞水平：活化巨噬细胞、刺激淋巴细胞有丝分裂、产生抗前列腺素以及使肿瘤细胞坏死的作用。③分子水平：活化补体和纤维蛋白溶酶原及鲎细胞溶解物(鲎试剂)凝集。

1.4 细菌内毒素的毒性反应 细菌内毒素由于其特殊的生物活性，会对肌体产生毒性反应[11]。

1.4.1 发热反应 人体对细菌内毒素极为敏感。极微量(1～5 ng/kg)内毒素就能引起体温上升，且发热反应持续约 4 h后，才能逐渐消退[12]。人体自然感染时，因为革兰阴性菌会不断生长繁殖，而且同时会伴有细菌陆续死亡，并释出内毒素，所以发热反应将持续至体内病原菌完全消灭为止。内毒素引起发热反应的原因是内毒素作用于体内的巨噬细胞，使其产生白细胞介素1、6和肿瘤坏死因子-α等细胞因子[13]，这些细胞因子作用于宿主下丘脑的体温调节中枢，促使体温升高发热。

1.4.2 白细胞反应 细菌内毒素进入宿主体内以后，由于细胞发生移动并黏附到组织毛细血管上，血流中占白细胞总数60%～70%的中性粒细胞数量迅速减少。但在1～2 h后，由内毒素诱生的中性细胞释放因子刺激骨髓释放其中的中性粒细胞进入血流，使其数量显著增加，有部分不成熟的中性粒细胞也被释放出来[14]。革兰阴性菌的伤寒沙门菌是例外，其内毒素使白细胞总数始终是减少状态，目前还不清楚是什么原因。由于绝大多数被革兰阴性菌感染的患者血流中白细胞总数都会增加，所以医生在诊断前，为了初步区别是细菌性感染还是病毒性感染，常常要检验病人的血液，对白细胞进行总数测定和分类计数[15]。被病毒感染的病人，其白细胞总数和中性粒细胞百分比基本在正常值范围内。

1.4.3 内毒素休克 当病灶或血流中革兰阴性病原菌大量死亡，释放出来的大量内毒素进入血液时，可发生内毒素血症。大量内毒素作用于肌体的巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、血小板，以及补体系统和凝血系统等，便会产生白细胞介素1、6、8和肿瘤坏死因子-α、组胺、5-羟色胺、前列腺素、激肽等生物活性物质。这些物质作用于小血管造成功能紊乱而导致微循环障碍，临床表现为微循环衰竭、低血压、缺氧、酸中毒等，于是导致病人休克，这种病理反应叫做内毒素休克[16]。

在有效的抗菌治疗后，由于血中细菌大量死亡崩解，可加重内毒素血症。因此，在临床上可能出现感染已控制而以器官损害为特点的病情继续恶化的情况，此时需要抗内毒素治疗。

大量的动物实验及临床实践表明，内毒素可造成人及动物多系统的多种疾病，其中包括肺损伤、肝损伤、肠损伤、肾损伤及弥漫性血管内凝血、感染性休克、酸中毒及全身多功能脏器衰竭[17]。

2 细菌内毒素检查法的应用

随着对内毒素生物学功能研究的深入，发现血循环中的内毒素与肌体多种疾病的发生有关，因此内毒素检测在临床医学、药学及生命科学的相关研究中有非常重要的作用。

现在细菌内毒素最常用的检查法一般是鲎试剂试验法， 1964年由美国学者Levin和Bang发现微量革兰阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应，从而在1968年创立了一种定性或定量检测微量细菌内毒素的体外分析方法(鲎试剂检测法)[18]。由于其灵敏度高、特异性强而且操作简便、快捷，目前在许多领域得到了突飞猛进的发展。从此方法建立以来，各国科研人员在细菌内毒素的本质和方法学方面的研究不断深入和发展，加之各种新型仪器的开发，其应用已深入到药学、医学、微生物学以及临床检验等各个领域。

1980 年，《美国药典》第20版首先收载鲎试剂法作为细菌内毒素检查法，随后欧洲、日本药局等各方也相继收载了这一方法。1995 年，《中国药典》 1995 版二部附录收载了修订后的细菌内毒素检查法[15]。2003 年，对细菌内毒素定量检测开始在我国临床全面开展应用。现在细菌内毒素检查法作为替代注射剂热原检查的一种新试验方法，不仅在试验方法上越来越统一和协调，而且在检验品种数量上也是逐年递增。由此可见，用细菌内毒素检查法(鲎试剂法)替代热原检查是一种趋势。随着研究的不断深入，细菌内毒素检查法的应用也越来越广泛。

2.1 在临床的应用 体液内毒素水平是监测和诊断严重细菌性炎症反应(尤其是革兰阴性菌)的一个重要特异性指标[19]。内毒素水平的检测在临床上主要有如下几种应用[20]：① 监控具有感染危险的患者，尤其在对于ICU病区感染性疾病患者的治疗中，及早进行细菌内毒素检测，有助于临床的及早诊断和治疗，有很高的临床意义[21]；② 细菌性炎性疾病的鉴别诊断[22]；③ 监控病程和防御脓毒血症；④ 原因不明的发热和败血症预测性指标[23]； ⑤ 血液透析液的检测：血液透析液是尿毒症患者得以生存的基础，所以为了保证血液透析液的质量，检查其中的内毒素对于保证临床上的治疗效果和患者的安全有着至关重要的作用[24，25]；⑥ 其他：细菌内毒素检查还可用于饮用水检测[26]、医用的明胶检测[27]、临床使用的水胶体敷料检测[28]。

2.2 药品中的应用 主要是注射剂，也有少量固体制剂，涉及的种类包括中药、化学药、药物中间体、药用辅料等[29-35]。用细菌内毒检查法代替热原法也符合动物福利的3R原则，所以细菌内毒素检查法今后的应用会越来越多。

2.3 医疗器械中的应用 主要是指输液器、注射器以及输血器、医用制品等。一般常用的试验液主要是用注射用水或生理盐水来进行调制，但各国标准差异较大，所以对试验液的调制条件要求也各异，一般浸提时间、浸提温度对医疗器械的细菌内毒素的影响较大[36，37]，在实际检测中要特别注意。

2.4 血液中细菌内毒素的测定 主要是用于肌体血液中的细菌内毒素监测，为临床诊断提供实验数据。但由于血液中含有许多干扰鲎试剂试验反应的物质(如各种蛋白酶抑制剂、内毒素结合蛋白等)[38]，因此，对这些干扰物质的除去即血液的前处理工作是极为重要的。

3 小结

细菌内毒素与人们健康生活的很多方面密切相关，检测各种样品中的细菌内毒素，对于药品、医疗器械的安全以及临床上相关疾病的早期诊断具有重要的意义。随着免疫学、生物学等各个学科的不断深入研究和发展，细菌内毒素的检查法也越来越先进，但鲎试剂法中的鲎是一种珍稀动物，保护鲎资源也是义不容辞的责任，所以在细菌内毒素的检查替代法方面也要不断作出努力，同时要在具体实验中不断探索，不断完善实验方法，真正做到经济和高效，人与自然的和谐。

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2015-03-17

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1006-5687(2015)05-0066-04

*通讯作者：李倚云，E-mail：343559262@qq.com。