禽流感-新城疫重组二联活疫苗与重组禽流感灭活疫苗组合免疫效果观察

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（1.广西柳州市柳北区动物疫病预防控制中心，广西 柳州 545002；2.广西柳州市柳北区水产畜牧兽医局，广西 柳州 545002；3.广西柳州市柳北区动物卫生监督所，广西 柳州 545002；4.广西柳州市动物疫病预防控制中心，广西 柳州 545005）

禽流感-新城疫重组二联活疫苗与重组禽流感灭活疫苗组合免疫效果观察

杨飞燕1，刘 颖1，张 廉1，陆成春2，雷 振3，许宗丽4

（1.广西柳州市柳北区动物疫病预防控制中心，广西 柳州 545002；2.广西柳州市柳北区水产畜牧兽医局，广西 柳州 545002；3.广西柳州市柳北区动物卫生监督所，广西 柳州 545002；4.广西柳州市动物疫病预防控制中心，广西 柳州 545005）

为进一步了解、掌握禽流感-新城疫重组二联活疫苗及与重组禽流感灭活疫苗组合使用的免疫效果，本研究以麻花鸡作为试验对象，制定了4种不同的免疫程序，分别对4组试验鸡群进行免疫，通过测定各组鸡只产生的免疫抗体效价和免疫抗体合格率，以评价二联活疫苗及与禽流感灭活疫苗的免疫效果。试验结果表明：禽流感-新城疫重组二联活疫苗单独用于肉鸡禽流感H5免疫预防抗体效价低于4 log2；建议禽流感-新城疫重组二联活疫苗可以与重组禽流感病毒灭活疫苗组合使用，两种疫苗免疫时间间隔2周左右，以免抑制机体产生对新城疫的免疫应答。

禽流感；新城疫；重组二联活疫苗；重组禽流感灭活疫苗；抗体效价；抗体合格率

世界动物卫生组织（OIE）规定的A类传染病中，禽类烈性传染病只有两种，分别是高致病性禽流感和新城疫[1]。使用禽流感-新城疫重组二联活疫苗可一次完成高致病性禽流感和新城疫的免疫，收到一种疫苗预防两种重大疫病的效果。禽流感-新城疫重组二联活疫苗是以新城疫Lasota弱毒病毒为载体，将禽流感H5的HA基因片段插入到Lasota载体中制作的疫苗，是更为新型的负链RNA病毒活载体疫苗，其生产技术在国际上具有领先水平[2]。

目前在基层动物防疫，特别是在农村散养户家禽防疫中普遍使用的禽流感-新城疫重组二联活疫苗方便、省事，很受村级动物防疫员和农户的欢迎。但按照该疫苗的使用说明，生产实践中单独使用该疫苗所取得的禽流感免疫效果并不理想。2012年柳州市重大动物疫病防控验收工作时，特意挑选辖区内2个乡镇2个村屯共20只二次免疫了禽流感-新城疫重组二联活疫苗的散养家禽，供采血检测禽流感和新城疫抗体。结果显示禽流感平均免疫抗体为＜1log2，平均合格率为0；新城疫平均免疫抗体为7log2，平均合格率为85%。为了进一步了解、掌握单独使用禽流感-新城疫重组二联活疫苗的免疫效果，以及与禽流感灭活疫苗联合使用的免疫效果，本研究以麻鸡作为试验对象，制定4种不同免疫程序，分别用于4组试验鸡群。通过应激反应观察、抗体效价检测、抗体合格率等参数，以评价二联活疫苗及与禽流感灭活疫苗的实际免疫效果，探索免疫方案，指导免疫工作，为禽流感、新城疫的预防和控制工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验疫苗 禽流感-新城疫重组二联活疫苗（rLH5-6株）（AI-ND），哈尔滨维科生物技术开发公司，生产批号2013111；重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型Re-6株）（AI），广东永顺生物制药股份有限公司，生产批号2013045；新城疫灭活油乳剂疫苗（ND），广东大华农动物保健品股份有限公司，生产批号190032008。

1.1.2 试验动物 15日龄麻花鸡，由柳州市柳北区顺发禽苗经营部提供。

1.1.3 诊断试剂 哈尔滨维科生物技术开发公司生产的禽流感H5（Re-6）株抗原，批号2013003，有效期2年；禽流感H5阳性血清，批号2013002，有效期2年；哈尔滨生物制品国家工程研究中心有限公司生产的新城疫抗原，批号14M001，有效期2年；新城疫阳性血清，批号14M001，有效期2年；红细胞悬液采自农户非免疫鸡血清，按常规方法制备成1%悬液。

1.1.4 其它药品器材 5g/L灭菌生理盐水、抗凝剂、微量移液器、离心机、96孔V型板等。

1.2 方法

1.2.1 试验方案 本次试验于2014年3月-6月在柳州市柳北区顺发禽苗经营部提供的养殖场内进行，试验设试验组和对照组，试验组又分4个小组，每组40只鸡，分别圈养（表1）。

表1试验方案

1.2.2 血清样本采集 疫苗接种后以一定间隔时间每组随机采样10～12份，检测禽流感H5和新城疫抗体。禽流感H5抗体按照GB/T18936-2003高致病性禽流感诊断技术-血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验进行检测；新城疫抗体按照GB16550-2008新城疫诊断技术-血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验进行检测。

2 结果与分析

2.1 鸡群免疫后应激反应情况 试验1组、2组、3组应激反应较轻，仅仅表现为采食量减少，2～3d后就恢复正常；试验4组应激反应较大，表现为采食量减少，少部分鸡只食欲不振，脚软，死亡率5%左右。

2.2 各组试验鸡抽样检测禽流感H5抗体和新城疫抗体效价（表2、表3和图1、图2）。

表2 禽流感H5抗体合格率和抗体效价（单位：%、log2）

表3新城疫抗体合格率和抗体效价（单位：%、log2）

图1 各组禽流感H5抗体效价对比图

图2 各组新城疫抗体效价对比图

2.3 试验1组中二次免疫禽流感-新城疫重组二联活疫苗，结果表明：二联活疫苗刺激肉鸡产生的禽流感H5抗体效价和抗体合格率均较低，最高分别只有1.6 log2和20%，达不到有效保护；新城疫抗体效价和抗体合格率则较高，峰值达到7.3log2和100%，但维持时间较短。这与我们2012年重大动物疫病防控验收抽检的20只散养户家禽的抗体效价基本一致（图1、图2、图3）。其原因不得而知，据有关资料介绍：禽流感病毒和新城疫病毒均具有血凝素，且均为保护性抗原，在同一个载体上同时具有两种血凝素抗原需要结合到受体位点上，即在免疫应答时是否存在两种血凝素抗原位点需要竞争性结合血凝素受体位点，而新城疫的血凝素受体位点借助于自身病毒空间结构优势，比禽流感的H5血凝素结合受体位点更具有优势[3]。

2.4 试验2组中第一次免疫禽流感-新城疫重组二联活疫苗，第二次分别免疫重组禽流感病毒灭活苗和新城疫油苗。结果表明：二次免疫后7天即37日龄就开始产生禽流感抗体效价，45日龄达到峰值9.1log2，并能维持一个月左右时间的较高抗体滴度，抗体合格率也随着抗体效价的升高而升高，最高达到100%；二次免疫新城疫油苗后1周抗体效价会有所下降，之后就持续上升，最高抗体效价于63日龄出现，为8.4log2，维持时间也较长。抗体合格率于45日龄达到100%，之后一直维持高抗体合格率（图1、图2、图4）。灭活疫苗具有比较稳定及诱导产生的抗体水平均一等优点，但其存在接种后产生应答的潜伏期相对较长，成本偏高等不足[1]。本组试验鸡分别接种禽流感灭活疫苗和新城疫油苗，都产生了较高水平且均一的抗体效价，进一步验证了灭活疫苗比较稳定、诱导产生的抗体水平均一等优良的特性。

2.5 试验3组中第一次免疫禽流感-新城疫重组二联活疫苗，第二次免疫重组禽流感病毒灭活苗。结果表明：禽流感抗体滴度与试验2组基本一致，峰值达到8.8 log2，并能维持较长时间，抗体合格率也较高。新城疫抗体滴度于37日龄达到峰值6.8 log2，之后就缓慢下降，53日龄后低于5 log2，维持时间较短，抗体合格率也于53日龄后降到70%以下（图1、图2、图5）。

2.6 试验4组中第一次和第二次都是同时免疫禽流感-新城疫重组二联活疫苗和重组禽流感病毒灭活苗。结果表明：禽流感抗体滴度于第一次免疫后1周即22日龄呈缓慢上升趋势，到第二次免疫日龄即30日龄时平均抗体滴度达到3.5 log2，二免后2周即45日龄达到峰值7.9 log2，并能维持较长时间。抗体合格率37日龄后达到100%，最低也能达到70%以上；新城疫抗体效价却很低，最高也只有4.3 log2，平均抗体合格率33%，达不到国家对新城疫免疫的要求（图1、图2、图6）。试验结果与司兴奎等[4]研究的结论基本一致，重组禽流感灭活苗与禽流感-新城疫重组二联活疫苗同时接种可抑制机体产生对新城疫的免疫应答，但具体机制尚需进一步研究。

图3 试验1组禽流感抗体效价和新城疫抗体效价结果比较

图4 试验2组禽流感抗体效价和新城疫抗体效价结果比较

图5 试验3组禽流感抗体效价和新城疫抗体效价结果比较

图6 试验4组禽流感抗体效价和新城疫抗体效价结果比较

3 小结与讨论

3.1 本试验用禽流感-新城疫重组二联活疫苗（rLH5-6株）单独免疫，以及与重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型Re-6株）组合采用不同的免疫方法接种商品肉鸡，结果提示，禽流感-新城疫重组二联活疫苗（rLH5-6株）单独用于肉鸡禽流感H5免疫预防抗体效价低于4 log2。据有关资料介绍，禽流感最低保护临界值为4 log2-6 log2之间，且必须大于4 log2[5]，重组二联苗免疫保护的临界值为3 log2左右[6]。如果鸡群抗体效价长期低于4 log2，就不能实现有效保护。有研究以鸡痘病毒为载体表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组疫苗接种SPF鸡的试验结果免疫后抗体滴度也较低，但通过攻毒试验，仍能够抵御同亚型禽流感病毒的致死性攻击，保护效果达到或优于灭活苗[7]。禽流感-新城疫重组二联活疫苗（rLH5-6株）是否也存在这种情况，未见相关报道。限于实际条件，未能开展强毒攻击保护试验，对此需进一步研究证实。

3.2 根据本次试验的结果，建议禽流感-新城疫重组二联活疫苗（rLH5-6株）与重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型Re-6株）组合使用，以增强机体对禽流感的免疫应答强度。但两种疫苗免疫时间最好间隔2周左右，以免抑制机体产生对新城疫的免疫应答。

3.3 本次试验中禽流感-新城疫重组二联活疫苗（rLH5-6株）免疫后产生的新城疫抗体迅速、效价较高，但维持时间不长，这也验证了活疫苗免疫后群体抗体水平不均一和稳定性差等缺点的特性。建议在临床生产中禽流感-新城疫重组二联活疫苗（rLH5-6株）做新城疫基础免疫后，间隔一段时间后要加强新城疫的免疫，以保证确切的新城疫免疫效果。

[1] Saif YM，et al//苏敬良，高福，索勋，等译.禽病学[M].第11版.中国农业出版社，2005：66-93，147-177.

[2] 林永坚，关建新，袁海峰，等.快大型商品肉鸡禽流感母源抗体的监测及禽流感-新城疫重组二联活疫苗配合禽流感灭活疫苗免疫鸡只的效果观察[J].中国畜牧兽医，2007，34（11）：99-101.

[3] 陆桂丽，汪萍，沙依兰古丽.等.禽流感-新城疫重组二联活疫苗（rL-H5株）接种肉鸡后免疫抗体水平消长规律分析[J].中国兽医杂志，2010，46（12）：39-42.

[4] 司兴奎，陈建红，张济培.新城疫-禽流感重组二联活疫苗（rL-H5株）的免疫效果分析[J].广东畜牧兽医科技，2007，32（3）：24-28.

[5] 吴庭才，张春杰，郭向鹏.禽流感母源抗体消长规律和免疫保护抗体临界值的测定[J].河南科技大学学报（农学版），2002，22（4）：243-244.

[6] 曹立辉，卢冬梅，李秀英，等.禽流感-新城疫重组二联活疫苗（rL-H5株）对商品肉鸡的免疫效果观察[J].中国家禽，2011，33（4）：61-62.

[7] 贾立军，张艳梅，李军伟，等.H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的免疫效力[J].扬州大学学报（农业与生命科学版），2003，24（2）：11-13.

Analysis of Immune Effects of Recombinant Live AI-ND Vaccine and Recombinant Inactivated AI Vaccine in Chickens

Yang Feiyan1，Liu Ying1，Zhang Lian1，Lu Chengchun2，Lei Zhen3，Xu Zongli4Liubei Animal Disease Prevention and Control Center，Liuzhou，Guangxi 545002；2. Liubei Aquatic Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Liuzhou，Guangxi 545002；3. Liubei Animal Health Supervision Institute，Liuzhou，Guangxi 545002；4. Liuzhou Animal Disease Prevention and Control Center，Liuzhou，Guangxi 545005）

In order to compare the immune results of recombinant live avian inf uenza and Newcastle disease（AIND） and recombinant inactivated avian inf uenza vaccine（AI） in chickens，4 different immunization procedures were conducted respectively over 4 test groups for evaluation of immune effects of recombinant live AI-ND vaccine and recombinant inactivated AI vaccine through examination of immune antibody titer and yield in the 4 test groups. The test results showed that：when the recombinant live AI-ND vaccine was used alone，the H5 AI immune antibody titer in broilers was less than 4log2. It was recommended that live AI-ND vaccine and inactivated AI vaccine should be used in combination with 2 weeks interval without inhibiting the immune response to Newcastle disease vaccine.

avian influenza；Newcastle disease；recombinant live AI-ND vaccine；recombinant inactivated AI vaccine；antibody titer；antibody qualif cation rate

S852.65

：B

：1005-944X（2015）01-0074-05