核磁共振检测血清代谢物组在原发性胆汁性肝硬化中的应用

苏　兰,杨　婧，唐映梅(综述)，杨晋辉(审校)

(昆明医科大学第二附属医院肝胆胰内科 云南省肝病研究中心，昆明 650031)



核磁共振检测血清代谢物组在原发性胆汁性肝硬化中的应用

苏兰△,杨婧，唐映梅(综述)，杨晋辉※(审校)

(昆明医科大学第二附属医院肝胆胰内科 云南省肝病研究中心，昆明 650031)

摘要：原发性胆汁性肝硬化(PBC)目前发病机制尚不明确。临床上很多患者的诊断仍主要靠肝组织活检，迫切需要寻找更简便可靠的诊断方法。应用核磁共振(NMR)技术检测PBC患者血清代谢物组，在近年来得到飞速发展。但该技术尚未成熟，目前未广泛应用于临床。该文就代谢组学的概况、NMR检测血清代谢物组的相关研究进展及其在PBC诊断中的应用予以综述，为该技术应用于临床做准备。

关键词：原发性胆汁性肝硬化；核磁共振；血清代谢物组

原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一种慢性肝内胆汁淤积性肝病，病因不清，调查显示PBC的发病率有逐年上升的趋势，且该病预后不良，从出现症状到死亡或行肝移植的平均时间为5～10年[1]。根据美国肝脏病学会2009年修订的PBC诊疗指南，目前PBC的诊断依据主要有：①血清生化检查提示胆汁淤积，肝源性血清碱性磷酸酶升高和(或)γ-谷氨酰转移酶升高；②抗线粒体抗体阳性；③病理学证据:肝组织学活检示非化脓性胆管炎和小叶间胆管梗阻，在排外其他原因引起的胆汁淤积后，具备以上3个条件中的2项即可诊断为PBC[2]。从以上标准可以看出，对于抗线粒体抗体阴性的患者，其最终确诊不得不依赖肝脏病理分析，但其高风险性和有创性的特点限制了其在PBC诊断中的广泛开展。所以，有必要重新寻找更简单、可靠的疾病诊断标志物。现就核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)检测血清代谢物组在PBC中的应用进展予以综述。

1代谢组学研究概况

代谢组学是在1999年，由Nicholson等[3]提出，并将其定义为以动物的液体和组织为研究对象，研究生物体对病理生理刺激或基因修饰产生的代谢物质质和量的动态变化，关注的对象为相对分子质量<1000的小分子化合物。Fiehn[4]将代谢组学按照研究目的不同分为4类：代谢物靶标分析、代谢轮廓(谱)分析、代谢组学、代谢指纹分析。与传统的代谢研究不同，代谢组学研究更为全面，其从整体上研究生物样本中全部的代谢组分，目前已应用于植物、分子表型、功能基因组学、药物毒性、药物疗效、分子病理学及疾病的诊断等许多领域[5]。与较早出现的基因组学和蛋白质组学相比，代谢组学与生理学的联系更加紧密。疾病导致机体病理生理变化过程，可引起代谢产物发生相应的改变，通过对正常人和患者的某些代谢产物进行分析，可寻找疾病的生物标志物，这将为疾病的诊断提供更好的方法。代谢组研究的一个重要部分是比较分析健康状态与疾病状态下小分子代谢物表达的差异，这有助于人们寻找各种疾病早期诊断的生物标志物，并可用于疾病预后及治疗效果的评判。代谢组学研究的优势在于：①代谢物是基因和蛋白表达放大，使检测更容易；②基因及蛋白表达需要全基因组测序或建立大量表达序列标签的数据库，而代谢组学不需要；③代谢物的种类远小于基因和蛋白的数目，这在检测上更简便；④生物体液的代谢物分析可反映机体系统的生理或病理状态；⑤不同生物体内的代谢成分是一样的，使代谢组学技术具有更好的通用性[6]。完整的代谢组学分析流程主要包括样品采集及预处理、数据采集及预处理、多变量数据分析、目标物识别和研究结果的解释与应用等步骤，代谢组学研究最常用的样本有尿液、血清或血浆[7]。研究中较常用的方法包括NMR、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用，几种方法各有优缺点：①NMR是一种基于具有自旋性质的原子核在核外磁场作用下，吸收射频而产生能跃迁的谱学技术；NMR技术对样品的需要量少，几乎不需要对样品进行前处理，且NMR方法还能提供丰富的代谢产物的结构、浓度、分子动力学及相互作用等分子信息；而NMR技术最大的不足在于灵敏度低、分辨率不高，随着近年来技术的改进，上述缺点将逐渐被改进[8]；②气相色谱-质谱联用技术适宜分析小分子、热稳定、易挥发、能气化的化合物，气相色谱-质谱联用操作前需要对样品进行衍生化处理，衍生化预处理不仅费时且其过程会丢失某些物质的信号[9]；③液相色谱-质谱联用可分析高极性、更高相对分子质量及热稳定性差的化合物，超高效液相色谱飞行时间质谱联用技术是近年发展起来的一种对分析复杂样品很有效的方法[10]。与NMR相比，后两种技术在操作、样品要求及费用上要求均较高。近年来，为实现各类代谢物的高分辨、高通量分离分析，在有关色谱分离模式的选择、超高效/高压液相色谱系统开发以及多维色谱技术等方面都开展了大量的研究。

2NMR在血清代谢组学研究中的应用

NMR是指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂，让处于外磁场中的自旋核接受一定频率的电磁波辐射，当辐射的能量恰好等于自旋核两种不同取向的能量差时，处于低能状态的自旋核吸收电磁辐射能跃迁到高能状态，这种现象称为NMR[11]。NMR于20世纪70年代初开始应用于生物医学的研究，并于此后得到飞速发展。利用高分辨率NMR技术对完整器官或组织细胞内许多微量代谢组分进行检测，可得到相应的生物代谢信息。NMR方法的如下特点使其成为代谢组学中最为普遍研究手段：①对样品的结构和性质无损伤性；②能在接近生理条件下进行实验，实验条件更容易实现；③可研究化学交换、扩散及内部运动等动力学过程，给出信息较丰富，且为动态性；④可设计多种编辑手段，实验方法灵活多样[12]。样品进行NMR技术检测前几乎不需要进行处理，操作过程快速，可使用极少量的样本获得大量信息。

目前常用的NMR技术有氢谱、碳谱及磷谱3种，因氢谱对含氢化合物均有响应，能完成样品中大多数化合物的检测，满足代谢组学中对尽可能多的化合物进行检测的目标，所以氢谱应用最为广泛。早期的工作主要应用氢谱技术分析哺乳动物的尿液和体液样本。Tréhout等[13]采用高通量NMR技术，对缺血性肝衰竭导致肝性脑病的猪动物模型进行了生物人工肝支持系统治疗前后的血浆代谢组学分析，发现经海藻盐包被原代猪肝细胞生物人工肝治疗的肝衰竭猪的血浆胆碱、氧化三甲胺峰值较仅进行血浆置换治疗组下降，生存时间也较长。Yang等[14]应用高分辨魔角旋转氢谱技术对人肝细胞性肝癌进行检测，同时与正常肝组织对比，肿瘤组织中乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、胱氨酸、胆碱代谢物、磷酸乙醇胺等水平均明显升高，而三酰甘油、葡萄糖、糖原等水平明显下降；使用同样的方法在非肝硬化组织、肝硬化组织及低分化肿瘤组织进行检测，发现不同疾病状态下肝组织的代谢物也各有不同。Martínez-Granados等[15]采用高分辨力的磁共振波谱研究慢性肝炎引起的肝硬化患者离体肝活检组织，结果提示，慢性肝炎引起的肝硬化患者离体肝活检组织中谷氨酸、磷脂乙醇胺、磷酸胆碱、不饱和脂肪酸这4种代谢物较正常肝组织升高，而谷氨酰胺、天冬氨酸、游离胆碱和葡萄糖这4种代谢物则较正常低，并且发现谷氨酸、谷氨酰胺、葡萄糖似乎与肝硬化分期相关。Yap等[16]在研究甲烯酸丙酯诱导的大鼠肝毒性实验时，用高分辨力的磁共振波谱对肝毒性大鼠的肝脏进行测定，用氢谱对血浆和尿样进行测定，进而通过主要成分分析法发现脂类成分在肝组织中含量明显增高，这一结果与在血清中发现的脂类成分含量降低相吻合。

3代谢组学在PBC中的应用

疾病的发生会引起机体产生相应的代谢变化，通过代谢组学的研究，找出相关代谢标志物并建立科学的诊断模型，对于疾病诊断和分型将提供许多帮助。2002年，Brindle等[17]首先报道了应用代谢组学技术研究心血管疾病患者的血清和血浆的NMR谱图，并提出了判别心血管疾病及其严重程度的新诊断方法。肝脏是人体最主要的代谢器官，是三大物质代谢的枢纽，肝脏如果有病理生理改变，与之相关的代谢就会产生相应的变化，这时可以通过分析代谢产物成分，得到与肝脏病理生理过程相关联的生物学信息。代谢组学研究起步开始，就在肝病领域进行了大量研究。Robertson等[18]采用NMR和模式识别技术快速进行肝肾内毒性物质的代谢组学评价，同时使用四氯化碳、α-奈基异硫氰酸盐两种化合物制造肝脏损伤模型，发现了不同时间点的代谢物谱特征，提出代谢物特征可预测肝损模型严重程度的观点，并设想可作为预测指标。Van等[19]曾对肝硬化患者的肺泡气进行了对比研究，发现肝硬化患者的呼气中二甲硫醇以及部分酮体的水平明显升高，且二戊酮的水平与肝脏损害的严重程度呈正相关。Qi等[20]利用NMR方法分析肝硬化与肝癌细胞患者的血清代谢轮廓，得出了与上述相同的结论，发现两者的醋酸、丙酮酸等9种代谢物水平高于健康对照组，而低密度脂蛋白、异亮氨酸等7种代谢物水平低于对照组。连江山[21]利用线性梯度的超高效液相色谱飞行时间质谱技术研究发现，不同原因肝硬化患者血清中油酰胺和十四酰胺浓度的变化不同，这些脂肪酸酰胺在酒精性肝硬化患者血清浓度增加，但在乙型肝炎引起的肝硬化患者血清浓度降低。虽然各种原因引起的肝硬化病因不同，但均导致了弥漫性纤维化和再生结节的相同病理结局。PBC典型的病理改变可分为4期：胆管炎期、胆管增生期、纤维化期、肝硬化期，不同阶段肝组织的病理改变必然会影响肝脏在机体新陈代谢中的作用。近年来，关于PBC代谢组学的研究仍较少，刘薇[22]运用以液相色谱-质谱为基础的血液代谢组学研究方法对自身免疫性肝炎和PBC患者进行了血液代谢组学的初步研究，通过研究其与正常人间的血液代谢谱差异，鉴定出了胆汁酸、溶血卵磷脂等5类生物标志物。周豪[23]采用超快液相色谱-串联质谱联用的技术，建立以超快液相色谱-串联质谱联用为基础的代谢组学研究平台，发现了三酰甘油、磷脂酰胆碱等21种PBC的生物标志物。Trottier等[24]使用液相色谱法发现，PBC及原发性硬化性胆管炎患者的总胆汁酸、甘氨酸、牛磺酸均高于健康对照组。因此，尽管国内外关于PBC代谢组学的研究仍较少，但借鉴上述不同类型肝硬化以及肝癌的代谢组学研究思路，向PBC代谢组学研究领域扩展，相信其将为研究自身免疫性肝病发病机制提供一个新方法，为临床诊断提供新的思路。

4小结

代谢组学作为一门新兴的学科，其发展非常迅速。目前，代谢组学技术在PBC诊断的应用研究尚处于初步阶段。由于患病生物体内的所有小分子代谢产物都可被检测，提示可以寻找更多的可能生物标志物达到早期诊断、早期治疗的目的。NMR为非侵入操作，且不破坏样本，是现有代谢组学分析技术中唯一能用于活体和原位研究的技术[25]。相信随着分析手段和数据分析方式的不断完善，NMR的代谢组学在PBC的诊断、治疗以及预后判断将发挥更广泛的作用。

参考文献

[1]Boonstra K,Beuers U,Ponsioen CY.Epidemiology of primary sclerosing cholangitis and primary biliary cirrhosis:A systematic review[J].J Hepatol,2012,56(5):1181-1188.

[2]Lindor KD,Gershwin ME,Poupon R,etal.Primary biliary cirr-hosis[J].Hepatology,2009,50(1):291-308.

[3]Nicholson JK,Lindon JC,Holmes E.Metabonomics:understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica,1999,29(11):1181-1189.

[4]Fiehn O.Metabolomics-the link between genotypes and phenoty-pes[J].Plant Mol Biol，2002，48(1/2)：155-171．

[5]王斯婷,李晓娜,王皎,等.代谢组学及其分析技术[J].药物分析杂志,2010,30(91):1792-1799.

[6]Taylor J,King RD,Altmann T,etal.Application of metabolomics to plant genotype discrimination using statistics and machine lea-rning[J].Bioinformatics,2002,18(2):241-248.

[7]Beckonert O,Keun HC,Ebbels TM,etal.Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine,plasma,serum and tissue extracts[J].Nat Protoc,2007,2(11):2692-2703.

[8]王晶,汤柳英,杨杏芬,等.代谢组学技术及其研究进展[J].中国卫生检验杂志,2013,23(4):1046-1050.

[9]Metz TO,Zhang Q,Page JS,etal.The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery[J].Biomark Med,2007,1(1):159-185.

[10]Wilson ID,Plumb R,Granger J,etal.HPLC-MS-based methods for the study of metabonomics[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2005,817(1):67-76.

[11]Lenz EM,Bright J,Wilson ID,etal.Metabonomics,dietary influences and cultural differences:a 1H NMR-based study of urine samples obtained from healthy British and Swedish subjects[J].J Pharm Biomed Anal,2004,36(4):841-849.

[12]戴曰梅.核磁共振技术在生命科学领域的应用[J].兵工自动化,2013，32(4)：84-88.

[13]Tréhout D,Desille M,Doan BT，etal.Follow-up by one-and two-dimensional NMR ofplasma from pigs with ischemia-induced acute liver failure treated with a bioartificial liver[J]．NMR Biomed,2002,15(6):393-403.

[14]Yang Y,Li C，Nie X，etal．Metabonomic studies of human hepatocellular carcinoma using high-resolution magic-angle spinning 1H NMR spectroscopy in conjunction with multivariate data analysis[J].J Proteome Res,2007,6(7):2605-2614．

[15]Martínez-Granados B，Morales JM，Rodrigo JM，etal．Metabolic profile of chronic liver disease by NMR spectroscopy of human biopsies[J]．Int J Mol Med，2011，27(1)：111-117．

[16]Yap IK,Clayton TA,Tang H，etal．An integrated metabonomic approach to describe temporal metabolic disregulation induced in the rat by the model hepatotoxin allyl formate[J]．J Proteome Res，2006，5(10)：2675-2684．

[17]Brindle JT，Antti H，Holmes E，etal．Rapid and noninvasive diagnosis of the presence and severity of coronary heart disease using 1H-NMR-based metabonomics[J]．Nature Medicine，2002，8(12)：1439-1444.

[18]Robertson DG,Reily MD,Sigler RE,etal.Metabonomics:evaluation of nuclear magnetic resonance (NMR) and pattern recognition technology for rapid in vivo screening of liver and kidney toxicants[J].Toxicol Sci,2000,57(2):326-337.

[19]Van den Velde S，Nevens F，Van Hee P，etal．GC-MS analysis of breath odor compounds in liver patients[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2008,875(2):344-348．

[20]Qi SW,Tu ZG,Peng WJ,etal.1H NMR-based serum metabolic profiling in compensated and decompensated cirrhosis[J].World J Gastroenterol,2012,18(3):285-290.

[21]连江山.酒精性肝硬化和乙肝肝硬化患者血清代谢组学初步研究[D].杭州：浙江大学,2011.

[22]刘薇.自身免疫性肝炎和原发性胆汁性肝硬化血清代谢物组学初步研究[D].杭州：浙江大学，2012.

[23]周豪.原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎的代谢组学研究[D].长春：吉林大学，2011.

[24]Trottier J,Bialek A,Caron P，etal.Metabolomic profiling of 17 bile acids in serum from patients with primary biliary cirrhosis and primary sclerosing cholangitis:a pilot study[J].Dig Liver Dis，2012，44(4):303-310.

[25]邱青青,燕敏,李琛.代谢组学分析技术的新进展[J].诊断学理论与实践，2011,10(1):82-85.

Application of NMR in the Detection of Serum Metabolites Group of Primary Biliary CirrhosisSULan,YANGJing,TANGYing-mei,YANGJin-hui.(DepartmentofHepatology,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,YunnanCenterfortheStudyofLiverDiseases,Kunming650031,China)

Abstract:Primary biliary cirrhosis(PBC) pathogenesis is not clear at present,and the diagnosis of many patients still mainly relies on liver biopsy,so there is an urgent need to find a more convenient and reliable diagnostic method.Using nuclear magnetic resonance (NMR) to detect serum metabolites group in patients with PBC is a rapid development in recent years,though the technology is not yet mature,and not widely used in clinical practice currently.Here is to make a review of metabolomics research progress related to serum metabolomic NMR and its application in the diagnosis of PBC to prepare for the clinical application of the technology.

Key words:Liver biliary cirrhosis； Nuclear magnetic resonance； Serum metabolites

收稿日期：2014-07-15修回日期：2014-10-12编辑：郑雪

基金项目：云南省科技计划项目联合专项(2010CD170)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.11.045

中图分类号：R575

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)11-2042-03