多器官功能障碍综合征动物模型制作方法新进展

朱义超，孙　洁,修光辉，潘兴华(综述)，凌　斌※，朱光旭(审校)

(1.昆明医科大学第四附属医院重症医学科，昆明 650021； 2.成都军区昆明总医院临床实验科，昆明 650032)



多器官功能障碍综合征动物模型制作方法新进展

朱义超1△，孙洁1,修光辉1，潘兴华2(综述)，凌斌1※，朱光旭2(审校)

(1.昆明医科大学第四附属医院重症医学科，昆明 650021； 2.成都军区昆明总医院临床实验科，昆明 650032)

摘要：多器官功能障碍综合征(MODS)是当今危重症医学研究的重点，因病死率极高，研究其发病机制是有效治疗的根本，建立可重复性经济标准的动物模型是研究的基础。国内外对MODS的研究方向不同，所依据的模型制作原理也不尽相同，因此其动物模型的制作方法也有较大差别。该文对MODS的相关动物模型制作方法及优缺点予以综述，为相关实验研究提供参考。

关键词：多器官功能障碍综合征；动物模型；全身炎症反应综合征；休克

多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是危重症医学中极其常见的一种临床综合征，是指在严重创伤、感染、休克、大手术、病理产科及心肺复苏等状态下，机体同时或相继发生两个或两个以上器官系统功能衰竭的临床综合征，病死率极高。尽管现今医学技术已有了极大提高，但MODS患者的病死率仍达30%～40%，且随器官衰竭数量增多而增高[1]。作为临床上的急重症，其诱发因素较多，治疗措施也较为复杂，发病机制也是目前研究的重点。然而成功的模型是进行发病机制、治疗措施等研究的关键[2]，近来对于MODS动物模型的综合性研究报道较为稀少，现综合国际上MODS相关的各类研究，针对MODS动物模型的制作方法进行综述。

1MODS发病机制概述

MODS的发病过程较为复杂，因此其发病机制也较为复杂，目前主要有“缺血-再灌注”“细菌毒素”“基因诱导”“炎症失控”等假说。早在20世纪90年代，人们就已经认识到，失控性炎症反应是MODS的主要机制之一，全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是MODS发病的基础，细胞因子失控性释放是SIRS向MODS转化的关键[3-4]，但具体的调控机制以及作用原理至今不明。因此,如何建立较为标准的动物模型成为前提，只有建立既简便经济又可重复性强的标准实验动物模型，才能更好地对其发病机制进行深入研究，从而探索更好的治疗措施，降低病死率，提高治愈率。

2MODS模型的判断依据

目前国际上MODS的评判主要通过测定动物造模前后相应的器官功能的生理生化指标来评估[5]。通过造模前后对比，利用统计学方法分析其前后各数据的差异是否具有统计学意义。心血管及循环系统用心率、平均动脉压、肌酸激酶及同工酶、乳酸脱氢酶来代表其功能，相应的肺功能及呼吸系统用呼吸频率或动脉血氧分压及血二氧化碳分压代表，肾脏及泌尿系统用血肌酐、尿素氮以及尿量代表，肝脏、胃肠以及消化系统由转氨酶、总胆红素、胃肠活动、肠鸣音等代表，脾脏以及血液、免疫系统由凝血功能、白细胞计数、血小板计数等代表。除此之外，还应观察动物的基本情况，如体质量变化、体温变化、精神状态等。由于近来对SIRS诱发MODS的作用机制较为关注，各类炎性因子(如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6等)水平的测定也成为其参考的指标，这些因子均在造模后显著升高[6]。其各脏器的病理切片以及免疫组织化学结果也可证实各脏器的损伤情况[2]。

胡森等[7]在20世纪90年代即对MODS的动物模型做过系统的研究，他们根据人的SIRS诊断标准做出动物SIRS的评定参考动物SIRS的诊断依据：心率>2倍对照值，呼吸频率>2倍对照值或动脉血二氧化碳分压<75%对照值，直肠温度较对照值±0.8 ℃，白细胞计数>2倍对照值或<50%对照值。他们还认为，一个符合临床实际的理想的 MODS实验模型应具备的标准是：致伤因素与临床MODS常见诱因基本一致；发病在致伤24 h后；有SIRS的表现；有2个以上器官或系统的功能障碍；有足够的发病率和病死率。

由于所用动物的各项功能随饲养品种、饲养的不同也有较大差异，国际上目前也没有较为统一的动物生理指标参考，因此对MODS的判定结合目前国际主流评定方法，最好采取同等条件下的动物，取造模前后的血液标本和各项生理指标来做对比，对于差异有统计学意义的即可认为其脏器有功能异常，有两个及以上的脏器功能指标提示异常后即可认定MODS模型符合标准。

3国际常见的MODS实验动物模型制作

目前国际上通用的，比较常见的MODS动物模型主要有以下几种。

3.1出血休克模型Yang等[8]通过向大鼠股动脉置管，放掉血容量的40%来模拟出血性休克，失血后的48 h之内，连续记录评价动脉压和心率，同时输入等容积的生理盐水作为液体复苏。休克后1、24、48 h检测生化指标、肿瘤坏死因子α以及白细胞介素6的水平。休克后48 h,取肾、肝、肺和小肠做病理学检测。出血性休克模型是针对“缺血-再灌注”假说提出的制作方法，出血性休克通过复苏后会引起一些炎性介质的产生，其中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6等都将会引发MODS。该方法较好地模拟了临床失血性休克、创伤后引发的器官损伤，但此方法对于休克程度的把握要依靠相应的生理转换仪进行血压、心率等循环的监测；动物的大动、静脉置管操作一方面方便放血、回输，另一方面还要能有效监测循环功能。失血量的计算和控制是模型制作成败的关键，此类方法较为适用于体型较大、血容量较为充足的动物，如兔、猪、犬、猴等。

3.2肠缺血-再灌注模型肠缺血-再灌注模型是鉴于“缺血-再灌注”假说制作模拟的，该方法主要是通过夹闭动物的肠系膜上动脉40～60 min后进行液体复苏模拟肠缺血-再灌注而引发的MODS[9]。Zanoni等[10]认为，肠缺血和再灌注损伤的大鼠模型是关于肠系膜微循环以及菌群迁移方面在体实验相对理想的模型，而且该模型平衡了MODS发生和死亡两个事件的关联。该模型的制作方法较为一致，可重复性较好，但对动物的创伤较大，要进行较大的开腹、关腹操作，需注意操作的规范以及开腹之后的保温工作，比较适用于大鼠、小鼠这类体型较小的动物，体型较大的动物的围术期管理较为复杂，包括麻醉的维持时间的掌控、术中生命体征的维护等，而小型动物相对来说则易于控制。

3.3盲肠结扎穿孔模型目前国际上运用较多的MODS模型中盲肠结扎穿孔占了较大比例，该法通过结扎盲肠后并造成其穿孔来复制脓毒症模型[11]，各项生化指标检测前后均显著升高且大脑皮质、肝、肺、血管系统的组织病理学也均有损伤变化[12]。Daudel等[13]研究认为，微循环障碍是导致组织缺氧和败血症多器官功能衰竭的重要因素。该方法综合了创伤与肠黏膜缺血的双重打击诱发器官损伤，在一定程度上也是模拟了一种临床急重症的发展诱发的MODS，是对于缺血-再灌注模型的进一步改进，包含肠黏膜的缺血损伤以及脓毒症打击。此模型制作也需开腹手术，并确认盲肠位置进行结扎、穿刺等操作，需要研究者对各类动物的解剖结构较为了解，有一定难度，但此类方法手术时间较短，对麻醉和围术期管理要求较低，适用于各类动物。

3.4大肠埃希菌脂多糖模型依据“细菌毒素”的假说，模拟脓毒症的临床发展来引发MODS是近年来做的较多的模型，由于只需向大鼠体内腹腔或静脉注射脂多糖即可，操作方便，Collin等[14]按照不同的脂多糖浓度(6 mg/kg、20 mg/kg)分组静脉注射，模拟制作了严重内毒素血症的大鼠，大鼠在6 h 后肝脏出现损伤和功能障碍。Asakura等[15]通过大鼠尾静脉4 h内注射脂多糖(30 mg/kg)或静脉持续输注脂多糖1 mg/(kg·10 min) 10 min来制作大鼠弥散性血管内凝血模型。为了提高MODS的成功率，很多学者又对此进行了改进，结合了以往的一些方法，如Niu等[16]复制了两次打击模型，包括肠系膜血管夹闭和脂多糖的双重打击。两次打击后，天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、尿素氮、肌酐和 乳酸脱氢酶1显著升高。Qiao等[17]研究发现，静脉两次打击注射脂多糖(98 μg/kg、196 μg/kg)可以重建伴随多器官损伤的大鼠弥散性血管内凝血模型。但此方法的不足之处即是限于各种动物的质量以及实验条件，所用的脂多糖剂量差别较大，为6～30 mg/kg 不等，这与大肠埃希菌脂多糖的种类及批次、注射方式、动物状态等都有关，因此各研究者在做此模型时需要进行前期的摸索，针对所用动物和实验条件制订一个适合自己研究的剂量和方法。

3.5酵母多糖诱发炎症模型近年来越来越多的研究表明SIRS是MODS的关键，因此诱发SIRS的动物模型能较好地向MODS方向发展。Goris等[18]在20世纪80年代就创建了酵母多糖诱发炎症模型，即酵母多糖诱导产生的炎症模型。将酵母多糖粉剂用高频磁力搅拌器溶解于液体石蜡中混匀1 h 后100 ℃水浴80 min消毒灭菌，冷却37 ℃即可按照1 mg/g 的剂量向大鼠或小鼠进行腹腔注射。该模型动物在进展中，肝、肾尤其是肺和脾脏的干湿重随着病理组织的变化而出现渐变性的变化，老年大鼠比成年大鼠MODS的表现更为严重和提前[19]，肺脏、肝脏以及小肠的损伤可以通过生化检测以及组织学分析判断[4]。Volman等[20]对之前单纯的酵母多糖打击方案作了进一步的改进，首先进行脂多糖(40 μg)腹腔注射，6 d后腹腔注射酵母多糖(1 mg/g)可以降低在休克第一阶段的死亡率，利于MODS的发展。近些年，该模型的酵母多糖用量有所降低，大部分的用量在0.50～0.75 mg/kg[21]。酵母多糖诱发炎症模型现已经被大量地用于研究多器官衰竭，该模型也因其所用试剂剂量国内外较为统一，且所引起的MODS各项指标变化与人类临床发病特点相似，被认为是与人类MODS最为类似的动物模型[21-22]。该模型的缺陷也是其优势所在，即酵母多糖诱发炎症模型的制作较临床发病过程有一定偏差，但其也能够排除其他所有的临床病症，直接过渡到全身炎症失控性爆发这个层面引发MODS，对于MODS在炎症爆发以及各类炎性因子的作用调控方面的研究较为有利。

3.6其他MODS模型除以上所述各类动物的MODS模型外，还有一些其他制作方法，Lutmer等[23]报道了用烧伤来诱发MODS进行研究，去除小鼠体表面积的25%毛发后进行烧伤处理，也观察到了多脏器的功能障碍，主要是引起了肺脏的急性损伤。Wang等[24]利用延迟的水母咬伤综合征原理，通过使用水母素的提取物制作了延迟性水母咬伤综合征模型，发现也能对各靶器官造成损伤，形成MODS。但这些模型的制作缺乏较多的实验支持，其模型的稳定性有待验证。

4展望

当今对于MODS动物模型的制作并无固定统一的做法，但在制作过程中应注意标准的动物模型能够较好地反映临床发病特点，所用动物的遗传同源性也应尽可能接近于人，小鼠与人的同源性可以达到80%，大鼠的更是达到89%～90%[25]。模拟相关重大疾病创伤引发MODS的模型较为传统，通过引发脓毒症而引发MODS的模型，是更接近于MODS临床发生的一种做法，酵母多糖诱发的MODS模型则是对新阶段SIRS引发MODS理论的最好研究对象，排除了其他干扰因素，直接从引发全身性炎症出发。未来对于MODS的研究，或许会更倾向于两方面的考虑：①尽量模拟临床发病过程的脓毒症模型；②更纯粹的机制模拟的酵母多糖模型。

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New Progress in Modeling Methods of Multiple Organ Dysfunction SyndromesZHUYi-chao1,SUNJie1,XIUGuang-hui1,PANXing-hua2,LINGBin1,ZHUGuang-xu2. (1.TheIntensiveCareUnitDepartment,theFourthAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650021,China； 2.DepartmentofClinicalLaboratory，KunmingGeneralHospitalofChengduMilitaryCommandofChinesePLA，Kunming650032，China)

Abstract：Multiple organ dysfunction syndrome(MODS) is the focus of the critically ill study,due to the high mortality,the study of its pathogenesis is fundamental to find effective treatment and to establish repeatable and economic standard animal model is the basis of the research.The direction of research on MODS is different at home and abroad,and the basis of the model making the models is not all the same,therefore the model making methods are varied considerably as well.Here is to make a review of the MODS animal modeling approaches and their advantages and disadvantages,so as to provide a reference for the experiment and research.

Key words:Multiple organ dysfunction syndrome; Animal models; Systemic inflammatory response syndrome; Shock

收稿日期：2014-11-10修回日期：2015-01-08编辑：伊姗

基金项目：国家自然科学基金(81360289，81170316)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.003

中图分类号：R363

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)14-2502-04