象皮生肌膏对大鼠肛瘘创面修复中TGF-β1表达的影响

曹 晖，宾东华，王爱华，李 逵，马丽丽

(1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007)

象皮生肌膏对大鼠肛瘘创面修复中TGF-β1表达的影响

曹 晖1，宾东华1，王爱华1，李 逵2，马丽丽2

(1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007)

目的探讨象皮生肌膏对肛瘘术后创面修复的作用机制。方法将30只SD大鼠肛瘘术后创面造模，随机分为象皮生肌膏组、湿润烧伤膏组和凡士林组，每组10只，分别给予相应药物创面换药。动态观察各组治疗后创面修复情况及肉芽组织中转化生长因子β1(TGF-β1)的表达情况。结果象皮生肌膏组第8天、第14天创面愈合率及TGF-β1表达水平均明显高于其他2组(P均<0.05)，第14天创面愈合率湿润烧伤膏组高于凡士林组(P<0.05)；创面水肿评分明显低于其他2组(P均<0.05)，而湿润烧伤膏组低于凡士林组(P<0.05)；创面完全愈合时间明显短于其他2组(P均<0.05)，而湿润烧伤膏组短于凡士林组(P<0.05)。结论象皮生肌膏可明显提高肛瘘术后创面愈合率，缩短创面愈合时间，其促进肛瘘术后创面愈合的作用机制可能与调节创面中TGF-β1表达有关。

肛瘘；创面修复；TGF-β1；象皮生肌膏

肛瘘是肛门直肠瘘的简称。肛瘘作为一种比较常见的肛门直肠疾病，占我国占肛肠病发病人数的1.67%～3.6%，国外相对较高占8%～25%[1]。肛瘘不能自愈，必须采取手术治疗，同时由于肛瘘发病部位特殊，术后创面不易保持清洁干燥，所以肛瘘切口一般不予缝合，故术后创面多、愈合缓慢、伤口疼痛、病程长[2]。因此如何加速肛瘘术后创面修复，减轻术后疼痛，提高愈合质量成为肛肠科医师研究的重点课题之一。象皮生肌膏为湖南中医药大学第一附属医院自制药，前期临床观察已证明其能明显促进肛瘘术后创面修复，现通过动物实验来探讨其促进肛瘘术后创面愈合的作用机制。

1 实验资料

1.1材料

1.1.1实验动物 选用健康成熟未交配过的清洁级 Sprague-Dawley大鼠30只,雄15只,雌15只，体质量180～220g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(湘) 2013-0004。

1.1.2主要试剂与设备 象皮生肌膏(湖南中医药大学制剂研究室制备，湘药制字Z20070276)，湿润烧伤膏(汕头市美宝制药有限公司生产，国药准字Z20000004)，凡士林(湖南中医药大学制剂研究室制备)，金黄色葡萄球菌大肠杆菌混合菌液(湖南中医药大学微生物实验室提供)，生理盐水(湖南科伦制药有限公司生产，500mL，国药准字H43020480)，转化生长因子β1(TGF-β1)抗体、过氧化物酶标记二抗和ABC试剂盒(中国武汉博士德公司)，Sigma3K18型低温冰冻离心机(美国Sigma公司)，电子天平称Toledo(瑞士METTLER公司)，IMS细胞图像分析系统(美国Pierce公司)。

1.2方法

1.2.1动物造模 参照付小兵等[3]及郑雪平等[4]方法并加以改进制造肛瘘术后感染性创面的动物模型。术前对SD大鼠背部手术区域备皮，以10%水合氯醛经预试验确定为4mL/kg剂量腹腔注射进行麻醉，麻醉成功后，在备皮区用络合碘常规消毒，以直径2.0cm大小的圆形标记盖于备皮区印记进行标记，做一圆形切口，破坏皮肤全层及皮下浅筋膜直至肌层，止血后在创面上加浓度为1.0麦氏单位的金黄色葡萄球菌大肠埃希混合菌液浸泡过的湿纱布，用黑色医用丝线缝合3针进行固定，24h后去除纱布，见伤口有脓性分泌物为造模成功，使之形成一个“急性、开放、渗血、感染”的类似于临床肛瘘术后的感染性创面。以后每次治疗前0.5h在创面内滴加1.0麦氏单位大肠杆菌与金黄色葡萄球菌标准混合菌液0.1mL。

1.2.2分组及给药 将造模后的30只SD大鼠随机分为象皮生肌膏组、湿润烧伤膏组和凡士林组，每组10只。象皮生肌膏组伤口用络合碘常规消毒后，生理盐水冲洗，用等面积的象皮生肌膏纱条完全覆盖创面，其上再盖无菌纱布并固定。湿润烧伤膏组伤口用络合碘常规消毒后，给予生理盐水冲洗，用等面积的湿润烧伤膏纱条完全覆盖创面，再盖无菌纱布并固定。凡士林组伤口消毒冲洗后覆盖凡士林纱条，再盖无菌纱布并固定。3组均每天换药2次，连续用药14d。

1.3观察指标及方法

1.3.1创面愈合率 每天观察创面愈合情况，于治疗后第8，14天采用透明胶片描记测定局部创面面积，评价记录各组创面动态愈合率。创面愈合百分率(%)=(同组d0创面面积-同组dn创面面积)/同组d0创面面积×100%(n为治疗干预后的测量时间)。

1.3.2创面愈合时间 记录每组大鼠创面完全愈合(即完全上皮化)时间。

1.3.3创面水肿情况 记录治疗后第5,8,14天创面消肿情况，无水肿为0分；创面轻度水肿为1分；创面水肿明显，换药后缓解为2分；创面水肿重，需手术切除为3分。

1.3.4免疫组化检查 分别于治疗后第8,14天在无菌条件下用眼科剪剪取创缘新鲜肉芽组织，生理盐水清洗，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，无菌纱布沾干。应用免疫组化S-P法检测肉芽组织中TGF-β1表达水平(具体实验方法按照试剂盒说明书逐步操作)。

2 结 果

2.13组创面愈合率及完全愈合时间比较 治疗后第8，14天，象皮生肌膏组创面愈合率明显高于湿润烧伤膏组和凡士林组(P均<0.05)，治疗后第14天3组创面愈合率均明显高于第8天(P均<0.05)，且湿润烧伤膏组高于凡士林组(P<0.05)；创面完全愈合时间象皮生肌膏明显短于湿润烧伤膏组和凡士林组(P均<0.05)，湿润烧伤膏组短于凡士林组(P<0.05)。见表1。

表1 3组创面愈合率及愈合时间比较

注：①与治疗第8天比较，P<0.05；②与象皮生肌膏组比较，P<0.05；③与湿润烧伤膏组比较，P<0.05。

2.23组创面水肿情况比较 治疗后第5天，3组创面水肿评分比较差异无统计学意义(P均>0.05)。治疗后第8，14天，3组创面水肿评分均明显低于治疗后第5天(P均<0.05)，且治疗后第14天低于治疗后第8天(P均<0.05)；象皮生肌膏组水肿评分明显低于湿润烧伤膏组和凡士林组(P均<0.05)，湿润烧伤膏组低于凡士林组(P<0.05)。见表2。

表2 3组创面水肿情况比较分)

注：①与治疗后第5天比较，P<0.05；②与治疗后第8天比较，P<0.05；③与象皮生肌膏组比较，P<0.05；④与湿润烧伤膏组比较，P<0.05。

2.33组创面肉芽组织中TGF-β1表达情况比较 治疗后第8，14天，象皮生肌膏组TGF-β1表达明显高于湿润烧伤膏组和凡士林组(P均<0.05)，且各组治疗后第8天水平均高于治疗后第14天(P均<0.05)。见表3。

表3 3组创面肉芽组织中TGF-β1表达情况比较

注：①与象皮生肌膏组比较，P<0.05；②与治疗后第14天比较，P<0.05。

3 讨 论

肛瘘是肛管或直肠与肛门外皮肤相通的一种异常管道，一般由内口、瘘管、外口组成，主要表现为肛周流脓、疼痛、瘙痒和排便不畅等。肛瘘一般不能自愈，必须采取手术治疗，然而因肛门的特殊生理功能，每天会受到排便造成的机械性损伤和粪便污染，使肛瘘术后创面的愈合缓慢，病程长达1个月至数月，给广大的肛瘘患者造成了极大痛苦。因此如何促进肛瘘术后创面的愈合成了近年肛肠科医师重点关注的问题。

中医学将促进脓腐伤口愈合的作用分为清热解毒、祛腐提脓、生肌收口3个步骤[5]。中医生肌法是中医外科临床治疗大法之一，常用于“腐肉已脱，新肉不生”的各种急慢性创面，对于该疗法的理论论述和临床方药记载在历代中医古籍中都有丰富的论述。由于目前手术清创在现代医学的临床应用已经非常广泛和完善，肛瘘创面腐烂组织在术中已经被全部清除，因此在术后创面修复中生肌药物疗法才是中医的特色和优势。特别对于术后创面，如何更好、更快地生肌是需要解决的重点问题。

象皮生肌膏是湖南中医药大学第一附属医院中医外科在整理中医古代文献结合现代临床实践基础上总结出的行之有效的外科常用换药方，出自张山雷《疡科纲要》，并在其原方基础上对其药物及药量配伍稍加化裁，同时在制膏工艺上加以改进制成，药物组成主要包括象皮、当归、地黄、血余炭、炉甘石、石膏等。此膏药的主要药物象皮具有止血、敛疮的功效；当归补血活血、消肿止痛、排脓生肌；地黄具有清热、生津滋阴、凉血之功效；血余炭有消瘀、止血之功；炉甘石有解毒明目退翳、收湿止痒敛疮之功；石膏清热解毒、泻火。诸药合用具有清热活血、散瘀止痛、敛疮生肌的作用，针对腐肉已净、新肉未生的主要病理环节，充分调节体内阴阳气血，调其气化，最终达到生肌长肉的目的。该制剂药物性状稳定，外科临床用之于创面换药，生肌效果明显，能够缩短肛瘘患者术后创面愈合时间，减轻患者术后疼痛。

现代医学认为，创面修复过程存在一个极其复杂的信号网络调控机制，涉及组织、细胞、分子、基因等多个层面，任何一个环节的失控将会导致自身调节的失控。各种生长因子参与了伤口愈合的调控，在组织修复中有决定意义。其中TGF-β1属于TGF-β细胞因子超家族，是目前公认的与创伤愈合关系密切的细胞因子之一[6]，其主要作用是趋化成纤维细胞和炎症细胞向伤口聚集，诱导肉芽组织生长和表皮形成，是一类对创面修复有重要调控作用的多功能的细胞因子[7-9]。

本实验通过建立大鼠肛瘘术后创面模型，发现象皮生肌膏组治疗后第8，14天创面愈合率及创面完全愈合时间均优于湿润烧伤膏及凡士林组，创面水肿评分明显低于湿润烧伤膏组及凡士林组，而湿润烧伤膏组低于凡士林组。治疗后第8天，14天象皮生肌膏组TGF-β1的表达水平高于湿润烧伤膏组及凡士林组。治疗组第8天的TGF-β1表达水平高于第14天。表明象皮生肌膏在修复早期可能通过提高TGF-β1表达水平来加速创面愈合。

本实验结果提示生肌法代表药物象皮生肌膏能促进肛瘘术后创面愈合，缩短愈合时间，改善伤口水肿情况，能影响TGF-β1因子在创面中表达，可能是通过调控TGF-β1/Smad3信号通路来实现的，这也为临床推广应用此药提供了实验依据。然而创面愈合是一个多因素网格化相互作用的过程，故其更具体全面的作用机制还需更进一步的研究。

[1] 林毅,蔡炳琴.外科专病中医临床诊治[M].2版.北京:人民卫生出版社，2000:434-468

[2] 蔡而玮，徐照秀，陈民藩.紫白膏促进肛瘘术后创面愈合临床研究[J].实用中医药杂志，2005，21(3)：160

[3] 付小兵,孙同柱,盛志勇.几种用于创伤修复研究的动物模型[J].中华实验外科杂志,1999,16(5):479

[4] 郑雪平,许慧琴,丁义江,等.复方珠黄霜对兔背部人粪污染创面愈合的实验研究[J].中国中西医结合外科杂志,2002,8(5):361

[5] 马红锋，段义林.创愈膏在肛瘘术后的临床疗效观察[J].中国民族民间医药杂志，2004，69(4)：216-217

[6] Rhett JM,Ghatnekar,GS,Palatinus JA,et al.Novel therapies for scar.reduction and regenerative healing of skin wounds[J].Trends Biotechnol,2008,4(26):73

[7] Brunner G,Blakytny R.Extracellular regulation of TGF-bete activity in wound repair:growth factor latency as a sensor mechanism for injury[J].Thromb Haemost,2004,92(2):253-261

[8] 邱林，金先庆.转化生长因子β在创伤愈合、疤痕增生以及骨形成方面的研究与进展[J].中国临床康复，2005,9(10)：178-179

[9] 付小兵.慢性难愈合创面防治理论与实践[M].北京：人民卫生出版社，2011:135

Effect of Xiangpi Shengji ointment on the expression of TGF-β1in the wound repair of anal fistula of rats

CAO Hui1, BIN Donghua1, WANG Aihua1, LI Kui2, MA Lili2

(1.First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan, China; 2.Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan, China)

Objective It is to discusses the mechanism of Xiangpi ShengJi ointment in the wound repair of anal fistula.Methods 30SD rats were selected to establish the models of postoperative wound of anal fistula, then they were randomly divided into 3groups, respectively as Xiangpi ShengJi ointment group, moist burn cream group and vaseline group, each group had 10rats and were given respective drugs for dressing changes.The wound repair and the expression of TGF-β1in granulation tissue in every group were observed.Results The curing rate of wound and the expression rate of TGF-β1in Xiangpi ShengJi ointment group on the 8th and 14th day were significantly higher, while wound edema scores were lower, wound healing time was shorter than those in the other two groups (P<0.05), and on the 14th day, the indexes above including curing rate of curing rate, wound edema scores, wound healing time in moist burn cream group were better than that in vaseline group.Conclusion Xiangpi ShengJi ointment could obviously increase wound healing rate after anal fistula surgery, shorten wound healing time, and this mechanism may related with its regulation of the expression of TGF-β1in wound tissue.

anal fistula; wound repair; TGF-β1; Xiangpi ShengJi ointment

曹晖，男，副主任医师，副教授，硕士生导师，从事肛肠病研究工作。

湖南省中医药科研计划项目(201364)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.19.004

R-332

A

1008-8849(2015)19-2065-03

2015-01-30