硫氢化钠预处理大鼠肾缺血再灌注损伤对肝脏组织的影响*

贾小艳，陈勤，李飞，冯伟，杜靖

（1.新疆医科大学厚博学院，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学高职学院机能教研室，新疆乌鲁木齐 830011；3.武警新疆总队医院，新疆乌鲁木齐 830091）

硫氢化钠预处理大鼠肾缺血再灌注损伤对肝脏组织的影响*

贾小艳1，陈勤2，李飞3，冯伟1，杜靖2

（1.新疆医科大学厚博学院，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学高职学院机能教研室，新疆乌鲁木齐 830011；3.武警新疆总队医院，新疆乌鲁木齐 830091）

目的探讨硫氢化钠（NaHS）预处理大鼠肾缺血再灌注损伤（RIRI）对肝脏组织的影响。方法清洁级雄性Wistar大鼠30只，体重250～300 g，采用随机数字表法分为5组（n=6）：假手术组（S组）、肾缺血90 min再灌注60 min组（I/R 1组）、肾缺血120 min再灌注60 min组（I/R 2组）、NaHS+肾缺血90 min组（A组）、NaHS+肾缺血120 min组（B组）。采用右肾切除后左肾分别缺血90和120 min再灌注60 min的方法制备RIRI模型。A、B组于再灌注前20 min腹腔注射NaHS 100μg/kg，其余同I/R 1、2组。再灌注结束时腹主动脉采血3 ml，检测血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）含量，并取肾、肝脏组织，光镜下观察病理结果，酶联免疫法（ELISA）检测硫化氢（H2S）含量，肝脏组织采用硫代巴比妥酸显色法检测丙二醛（MDA）含量，二硫二硝基苯甲酸法检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果与S组比较，I/R 1、2组血清中Scr、BUN、ALT、AST含量升高，肾、肝脏组织H2S含量降低，肝脏组织MDA含量升高，GSH-Px活性降低，差异有统计学意义（P＜0.05），肾脏及肝脏组织出现病理损伤。与I/R 1组比较，I/R 2组血清中Scr、BUN含量升高，A组血清中ALT、AST含量降低，肾与肝脏组织H2S含量升高，肝脏组织MDA含量降低，GSH-Px活性升高，差异有统计学意义（P＜0.05），肾脏及肝脏组织病理损伤减轻。与I/R 2组比较，B组血清中ALT、AST含量降低，肾与肝脏组织H2S含量升高，肝脏组织MDA含量降低，GSH-Px活性升高，差异有统计学意义（P＜0.05），肾脏及肝脏组织病理损伤减轻。结论大鼠RIRI诱发远隔器官肝脏组织损伤与组织内H2S含量降低有关，外源性NaHS可减轻大鼠RIRI引起的远隔器官肝脏组织损伤，其机制与抗脂质过氧化作用有关。

硫氢化钠；肾缺血再灌注损伤；肝脏组织；丙二醛；谷胱甘肽过氧化物酶

肾缺血再灌注损伤（renal ischemia-reperfusion injury，RIRI）即肾脏在缺血的基础上恢复血流，组织损伤进一步加重［1］。肾脏由于其功能及血流分布特点，使其对缺血及缺血再灌注敏感，RIRI是临床上导致急性肾小管坏死和肾移植失败的重要因素［2］。许多研究显示［3-4］，RIRI不仅损伤原位组织器官，还会诱发远隔器官损伤，严重影响疾病的转归及预后。因此，研究防治RIRI及对远隔器官的影响，对解决临床实际问题有积极的指导意义。

硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）作为体内新型的气体信号分子，广泛参与机体多器官系统的功能调节。多项动物实验研究显示［5-6］，外源性H2S供体硫氢化钠（sodium hydrosulphide，NaHS）对组织器官缺血再灌注及远隔器官有保护作用，但其机制尚不清楚。本研究通过给予NaHS溶液对不同时间RIRI模型大鼠进行缺血前预处理，拟探讨H2S对不同时间RIRI大鼠肝脏组织的影响及机制，为RIRI的防治提供新手段。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级Wistar雄性大鼠30只，由新疆医科大学实验动物中心提供，体重250～300 g，采用随机数字表法分为5组（n=6）：假手术组（S组）、缺血90 min再灌注60 min组（I/R 1组）、缺血120 min再灌注60 min组（I/R 2组）、NaHS+肾缺血90 min组（A组）、NaHS+肾缺血120 min组（B组），实验开始前禁食12 h，自由饮水。

1.2 不同时间RIRI模型制备

10 %水合氯醛（0.5 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠后，鼠台固定，沿腹白线开腹约5 cm，钝性分离皮下组织与筋膜，暴露腹腔。S组游离双侧肾蒂，只穿线，不结扎。I/R 1组暴露右肾及肾蒂，双线结扎后切除右肾作为自身对照，再暴露左肾及肾蒂，分离肾包膜及左肾动脉，用1根丝线将开口一面朝上的塑料软管和动脉固定好，可见左肾颜色由鲜红变为暗红，肾缺血模型成功，缺血90 min后沿塑料管先前的切口剪开丝线，恢复动脉血供，若肾脏颜色逐渐由暗红变成鲜红色表明再灌注成功。I/R 2组缺血120 min后恢复组织血供，余操作与I/R 1组相同。A、B组于再灌注前20 min腹腔注射NaHS 100μg/kg（Sigma公司，美国），余操作同I/R 1、2组；S组、I/R 1组和I/R 2组以等容量生理盐水替代NaHS。操作完成后关闭腹腔，并于腹部覆盖纱布，手术灯光照射以保温并计时。

1.3 观察指标

再灌注60 min结束时打开腹腔，实验各组大鼠均腹主动脉采血3 ml，缓慢注入EP管，TGL-20M离心机（成都泰盟仪器公司）4℃、3000r/min离心10min后取上清液。意大利AUTOLAB自动生化仪检测血清肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen BUN）、丙氨酸氨基转移酶（alanine amino transferase，ALT）和门冬氨酸氨基转移酶（aepartate aminotransferase，AST）含量。采集完血样，断头处死大鼠，取左肾后将切口向大鼠头端延长，取肝脏左上叶。从中间剖开肾脏，与肝脏组织一同置于冷磷酸盐溶液（0.1 mol/L，pH值7.4）中冲洗干净并吸干表面水分，取肾下极和肝脏组织各一块置于10%中性甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光学显微镜BX51（Olympus公司，日本）观察病理变化。冰板上留取相同部位肾、肝脏组织各0.5 g，MP-2002分析天平（上海梅特勒托利多仪器有限公司）称重并以1∶9比例加入冷生理盐水，ZS-83-1型内切式组织匀浆器（成都泰盟仪器公司）制备组织匀浆，低温3 500 r/min离心10 min，取上清液，WD-2102A型自动酶标仪（北京六一仪器厂）、酶联免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测H2S含量，硫代巴比妥酸显色法检测肝组织中丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量，二硫二硝基苯甲酸法检测谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性（南京建成生物工程研究所）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，方差齐比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD法，方差不齐用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝、肾组织形态学变化

2.1.1 肝脏组织①S组肝细胞结构组织正常，肝细胞排列整齐，细胞核染色较浅，核质分布均匀，呈球形（见图1）；②I/R 1组肝小叶结构存在，部分肝细胞核浓缩，部分肝窦扩张（见图2）；③I/R 2组肝小叶结构存在，肝细胞显著水肿，肝细胞脂肪变性，肝窦扩张，枯否细胞轻度增生（见图3）；④A组肝小叶结构存在，个别肝细胞脂肪变性，枯否细胞轻度增生（见图4）；⑤B组肝小叶结构存在，肝细胞点、灶状坏死，肝窦扩张，枯否细胞轻度增生，汇管区轻度扩大，见少许淋巴细胞及浆细胞增生（见图5）。

2.1.2 肾脏组织①S组肾单位结构正常（见图6）；②I/R 1组肾小球毛细血管内皮轻度增生，肾小球球囊腔轻度增宽，肾小管上皮轻度水肿、空泡变性（见图7）；③I/R 2组肾小管上皮显著水肿，空泡变性，个别肾小管上皮细胞核消失，间质血管增生、扩张充血（见图8）；④A组肾小囊扩张，肾小管细胞变性程度减轻，未见明显异常（见图9）；⑤B组肾小球毛细血管内皮细胞轻度增生，肾小管上皮轻度水肿（见图10）。

2.2 肝、肾组织功能变化

图1 S组肝组织（HE×40）

图2 I/R 1组肝组织（HE×40）

图3 I/R 2组肝组织（HE×40）

图4 A组肝组织（HE×40）

图5 B组肝组织（HE×40）

图6 S组肾组织（HE×40）

图7 I/R 1组肾组织（HE×40）

图8 I/R 2组肾组织（HE×40）

图9 A组肾组织（HE×40）

图10 B组肾组织（HE×40）

与S组比较，I/R 1组和I/R 2组血清中Scr、BUN、ALT、AST含量升高；与I/R 1组比较，I/R 2组血清中Scr、BUN含量升高，A组血清中ALT、AST含量降低；与I/R 2组比较，B组血清中ALT、AST含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。方差齐性检验显示，FScr=0.982，P=0.397；FBUN=0.316，P=0.734；FALT=0.181，P=0.947；FAST=1.595，P=0.207。单因素方差分析显示，FScr=13.743，P=0.000；FBUN=155.072，P= 0.000；FALT=1235.374，P=0.000；FAST=1 254.459，P= 0.000。见表1、2。

2.3 肝、肾组织匀浆H2S含量

与S组左肾比较，I/R 1、2组自身对照右肾组织H2S含量差异无统计学意义（P＞0.05）；与S组左肾比较，肝、肾组织H2S含量降低；与I/R 1组比较，A组肝、肾组织H2S含量升高；与I/R 2组比较，B组肝、肾组织H2S含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。方差齐性检验显示，F肝组织=0.925，P=0.464；F肾组织= 0.612，P=0.657。单因素方差分析显示，F肝组织=35.805，P=0.000；F肾组织=11.077，P=0.000。见表3。

表1 大鼠血清Scr、BUN含量比较（n=6，±s）

表1 大鼠血清Scr、BUN含量比较（n=6，±s）

注：1）与I/R 1组比较，P=0.005；2）与I/R 1组比较，P=0.000；3）与I/R 2组比较，P=0.046；4）与I/R 2组比较，P=0.003；5）与S组比较，P=0.000

组别Scr/（μmol/L）BUN/（mmol/L）S组126.28±4.221）3.99±0.282）I/R 1组140.71±10.213）7.24±0.524）I/R 2组150.76±6.235）8.06±0.345）

表2 大鼠血清ALT、AST含量比较（n=6，u/L，±s）

表2 大鼠血清ALT、AST含量比较（n=6，u/L，±s）

注：1）与I/R 1组比较，P=0.000；2）与I/R 2组比较，P=0.056；3）与I/R 2组比较，P=0.060；4）与S组比较，P=0.000；5）与I/R 1组比较，P=0.040；6）与I/R 1组比较，P=0.048；7）与I/R 2组比较，P= 0.047；8）与I/R 2组比较，P=0.000

组别ALTAST S组32.41±3.591）51.43±3.351）I/R 1组151.47±3.892）250.70±3.323）I/R 2组154.60±4.864）253.10±4.524）A组144.60±3.675）206.70±5.936）B组148.59±3.617）238.75±9.778）

2.4 肝脏组织匀浆MDA含量及GSH-Px活性

与S组比较，肝脏组织MDA含量升高，GSH-Px活性降低；与I/R 1组比较，A组肝脏组织MDA含量降低，GSH-Px活性升高；与I/R 2组比较，B组肝脏组织MDA含量降低，GSH-Px活性升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。方差齐性检验显示，FMDA=2.535，P=0.65；FGSH-Px=2.489，P=0.076。单因素方差分析显示，FMDA=8.599，P=0.000；FGSH-Px=18.407，P=0.000。见表4。

表3 大鼠肝、肾组织中H2S含量比较（n=6，pg/ml，±s）

表3 大鼠肝、肾组织中H2S含量比较（n=6，pg/ml，±s）

注：1）与I/R 1组比较，P=0.001；2）与I/R 1组比较，P=0.000；3）与I/R 2组比较，P=0.524；4）与I/R 2组比较，P=0.041；5）与S组比较，P=0.000；6）与I/R 1组比较，P=0.046；7）与I/R 1组比较，P=0.000；8）与I/R 2组比较，P=0.000；9）与I/R 2组比较，P=0.046

组别肾肝S组319.65±27.151）387.29±20.562）I/R 1组265.13±24.193）361.50±19.944）I/R 2组258.81±21.365）339.45±16.125）A组279.61±18.266）394.77±32.327）B组286.79±13.998）360.28±43.759）

表4 大鼠肝脏组织MDA含量、GSH-Px活性比较（n=6，±s）

表4 大鼠肝脏组织MDA含量、GSH-Px活性比较（n=6，±s）

注：1）与I/R 1组比较，P=0.000；2）与I/R 2组比较，P=0.054；3）与I/R 2组比较，P=0.066；4）与S组比较，P=0.045；5）与S组比较，P= 0.000；6）与I/R 1组比较，P=0.044；7）与I/R 1组比较，P=0.036；8）与I/R 2组比较，P=0.039；9）与I/R 2组比较，P=0.030

组别MDA/（nmol/mg pro）GSH-Px/（u/g pro）S组9.37±3.921）1.55±0.061）I/R 1组14.68±1.502）0.99±0.173）I/R 2组16.38±1.454）0.95±0.175）A组11.95±1.766）1.20±0.127）B组13.07±1.458）1.29±0.089）

3 讨论

本实验采用右肾切除和左肾结扎后再灌注方法制备RIRI模型［7］，张荣等［8］选择肾缺血90和120 min后再灌注60min作为RIRI组，通过检测血清Scr、BUN含量及肾组织病理形态学改变验证制备模型。本研究中，与S组大鼠相比，I/R 1、2组血清Scr、BUN含量升高，肾组织有病理损伤，肾功能受损，与报道一致［9-10］，说明RIRI模型制备成功。

RIRI是一个十分复杂的病理生理过程，氧自由基产量大于肾脏自身抗氧化防御系统可引起脂质、蛋白质和DNA损伤，进而导致细胞功能障碍以及组织损伤［11］。肝脏是人体内最大的实质性脏器，血流量大，易受循环中的有害物质影响而致肝脏病理及肝功能损伤，因此本实验选择肝脏作为RIRI的远隔器官。RIRI造成远隔器官肝脏组织损伤机制尚不明确，推测可能机制为来源于肾脏的各种化学物质包括氧自由基、细胞因子、黏附分子等大量进入体循环。

MDA是不饱和脂肪酸过氧化分解的终产物，其含量的高低不仅可以直接反映体内脂质过氧化的强度和速率，还可以间接反应组织或细胞损伤的严重程度，常被作为判断缺血再灌注损伤的重要依据［12］。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，能催化还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）变为氧化型GSH，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进双氧水H2O2的分解，从而保护细胞膜结构及功能不受过氧化物的干扰和损害［13］。本研究选择上述2项指标，以探讨RIRI对远隔器官肝脏组织的影响是否与氧化应激有关，并以血清ALT、AST含量高低反映肝功能的受损程度。结果显示，与S组比较，I/R 1、2组血清ALT、AST含量升高，肝脏组织MDA含量升高，GSH-Px活性降低，肝、肾组织形态学出现损伤，提示大鼠RIRI可诱发肝脏组织损伤，其机制与抗氧化有关。因此针对抗氧化进行的靶向治疗可能对减轻RIRI诱发的远隔器官损伤具有一定的作用。

H2S作为一种气体信号分子，在体内1/3以气体H2S形式，2/3以NaHS形式存在。NaHS在体内通过解离作用与H2S形成一种动态平衡，且NaHS浓度便于精确定量H2S浓度，因此本研究以NaHS作为H2S供体。本实验前期研究中，外源性给予NaHS 100μg/kg能明显升高肾脏组织中H2S浓度，但对正常大鼠肾功能无显著影响，也不引起形态学改变。前期结果中H2S对RIRI大鼠肾组织及远隔器官脑组织有保护作用，其在肾、脑组织的含量高低与其损伤程度有关，但其机制尚不清楚。多项研究表明［14-16］，H2S可通过抗氧化作用减轻缺血再灌注组织、细胞损伤。本实验中，分别给予I/R 1、2组大鼠再灌注前20 min腹腔注射NaHS溶液，检测血清ALT、AST含量及肝脏组织MDA含量、GSH-Px活性，观察肝、肾组织病理改变并检测其H2S含量，研究RIRI大鼠引起的原位器官和远隔器官肝脏组织损伤是否与内源性H2S含量变化有关，给予外源性H2S供体是否可改善原位器官和远隔器官肝脏组织损伤，这种改善是否与抗氧化机制有关。研究结果显示，与I/R1组比较，A组血清中ALT、AST含量降低，肝、肾组织H2S含量升高，肝脏组织MDA含量降低，GSH-Px活性升高，肝、肾组织病理损伤减轻。与I/R 1组比较，I/R 2组血清Scr、BUN含量升高，肝脏组织H2S含量下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；I/R 2组肝、肾组织病理损伤表现更明显。I/R 1、2组血清ALT和AST含量、肝脏组织MDA含量、GSH-Px活性、肾组织H2S含量比较，差异无统计学意义，考虑与I/R 1、2组缺血时间相差较小有关，为今后的实验方向提供思路。与I/R 2组比较，B组血清中ALT、AST含量降低，肝、肾组织H2S含量升高，肝脏组织MDA含量降低，GSH-Px活性升高，肝、肾组织病理学损伤减轻，提示大鼠RIRI诱发的远隔器官肝脏组织损伤与组织内H2S含量降低有关；外源性NaHS可减轻大鼠不同时间RIRI引起的远隔器官肝脏组织损伤，其机制与抗氧化有关。

目前，H2S的抗氧化损伤作用机制尚不明确，近年来的实验研究指出：①H2S可通过激活核因子网织红细胞相关因子-2（nuclear factor cry-throid-2-related factor 2，Nrf-2）信号分子活性，调节细胞内氧化还原环境起到抗氧化作用［17-19］；②H2S通过下调NADH氧化酶活性，抑制活性氧物质产生［20］；③H2S通过提高细胞内还原型谷胱甘肽的生成能力及线粒体中谷胱甘肽的比重，提高抗氧化能力［14］。

综上所述，大鼠RIRI诱发的远隔器官肝脏组织损伤与组织内H2S含量降低有关，且随着肾缺血时间延长，再灌注后肾组织及远隔器官肝脏组织损伤加重，过氧化物水平升高。外源性NaHS可减轻不同时间RIRI引起的大鼠远隔器官肝脏组织损伤，其机制与抗氧化有关。

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（申海菊编辑）

Effect of sodium hydrosulfide preconditioning on hepatic tissue following renal ischemia-reperfusion injury in rats*

Xiao-yan JIA1,Qin CHEN2,Fei LI3,Wei FENG1,Jing DU2
（1.Houbo College,Xinjiang Medical University,Urumqi,Xinjiang 830011,P.R.China;2. Department of Medical Physiology&Biochemistry,Higher Vocational College,Xinjiang Medical University,Urumqi,Xinjiang 830011,P.R.China;3.Xinjiang Corps Hospital of the Chinese People's Armed Police Force,Urumqi,Xinjiang 830091,P.R.China）

【Objective】To observe the effect of sodium hydrosulfide（NaHS）on hepatic tissue following renal ischemia-reperfusion injury（RIRI）in rats.【Methods】Thirty male Wistar rats weighing 250～300 g were randomized into 5 groups（6 in each group）using a random number table:sham operation group（group S）; group I/R 1 with 60 min reperfusion following 90 min ischemia;group I/R 2 with 60 min reperfusion following 120 min ischemia;group A with NaHS+60 min reperfusion following 90 min ischemia and group B with NaHS+60 min reperfusion following 120 min ischemia.RIRI was induced by right nephrectomy and occlusion of the left kidney artery for about 90 min or 120 min followed by 60 min reperfusion in rats anesthetized with intraperitoneal chloral hydrate.NaHS 100 μg/kg was injected intraperitoneally 20 min before ischemia in the groups A and B,and the rest procedures were similar to those previously described in the groups I/R 1 and I/R 2.Blood samples were collected at the end of reperfusion to determine serum creatinine（Scr）,blood urea nitrogen（BUN）,alanine aminotransferase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST）concentrations.Kidney and hepatic tissue were removed for microscopic examination.The content of H2S was determined in the renal and hepatic tissuethrough enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.The content of malonaldehyde（MDA） was determined in the hepatic tissue through thiobarbituric acid method and the activity of glutathione peroxidase（GSH-PX）through 5,5-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid（DTNB）method.【Results】Compared with the group S,serum Scr,BUN,ALT and AST concentrations were significantly increased,the content of H2S in the renal and hepatic tissue was significantly decreased,the MDA concentration of hepatic tissue was significantly increased and GSH-PX concentration was significantly decreased in the groups I/R 1 and I/R 2（P＜0.05）.Microscopic examination showed that both kidney tissue and hepatic tissue were severely damaged. Compared with the group I/R 1,serum Scr and BUN concentrations were significantly increased（P＜0.05）; ALT and AST concentrations were significantly decreased,the content of H2S in the renal and hepatic tissue was significantly increased,the MDA concentration of hepatic tissue was significantly decreased and GSH-PX concentration was significantly increased in the group I/R 2（P＜0.05）and the pathological changes of both kidney tissue and hepatic tissue were significantly attenuated.Compared with the group I/R 2,ALT and AST concentrations were significantly decreased,the content of H2S in the renal and hepatic tissue was significantly increased,the MDA concentration of hepatic tissue was significantly decreased and GSH-PX concentration was significantly increased in the group B（P＜0.05）and the pathological changes of both kidney tissue and hepatic tissue were significantly attenuated.【Conclusions】Hepatic tissue injury induced by renal ischemiareperfusion in rats is associated with decrease in hydrogen sulfide content of tissue.Exogenous NaHS can attenuate hepatic tissue injury induced by renal ischemia-reperfusion in rats and antioxidant system is involved in the mechanism.

hydrogen sulfide;renal ischemia-reperfusion injury;hepatic tissue;malonaldehyde;glutathione peroxidase

R364.1

A

1005-8982（2015）23-0007-06

2015-02-09

新疆医科大学大学生创新性实验计划项目（No：CX2015085）

杜靖，E-mail：dujingzhw@qq.com