冷冻保护剂HSPM与人精子的作用时间对其活力影响的研究

朱俊+汪琳

摘要：目的 探索人精子在冷冻前与冷冻保护液HSPM的最佳作用时间。方法 16位健康者的精液装于16个冷冻瓶，按4个不同时间段（5、15、30、60min）共分四组进行。结果 作用4个不同时间段后，平均精子活力指数分别为：（0.360±0.231），（0.298±0.201），（0.313±0.222）及（0.248±0.119），差异有统计学意义（P<0.01）。结论 30min是精子与HSPM的最佳作用时间；对于少精者的精子应尽快冷冻。

关键词：HSPM；精子；冷冻复苏；精子活力

冷冻保存已广泛用于生殖领域临床，是人类生殖助孕技术的重要组成部分[1]。利用这项技术，长期有效的保存生殖细胞，解决了男性不育的许多具体问题；但冷冻损害却使人们的期望值打了折扣。精子冷冻复温后的存活率仅仅为35%～60%，与体细胞冷冻复温后的存活率可达90%相比较，远远不能令人满意[2，3]。于是，如何使冷冻保存的精子复温后的活力接近新鲜精液的活力，成了广大辅助生殖技术研究者潜心研究的课题。本文通过冷冻前精子与冷冻保护液HSPM作用4个不同的时间后观察精子活力的变化，了解HSPM冷冻保护液对精子活力的影响。

1 资料与方法

1.1精液标本采集 随机选取2013年6月～12月来自随州市妇幼保健院的健康标本16例。供精者年龄22～40岁，告知患者取精前禁欲2～7d，清洗双手和外生殖器，采用手淫法取精。精液纳入标准为：精液量≥2ml，精子密度≥70×106ml，精子活率（a+b）≥50%。

1.2试剂与仪器设备 精子冷冻保护液采用瑞典Nidacon公司生产的HSPM，含甘油、葡萄糖等成分。精液分析仪采用徐州广科GK-9900A 型，液氮罐为 MVE xc47 /11-10；冰箱为松下BCD-1900WE；水浴箱为美国Lab-Line 生产。

1.3方法

1.3.1待标本充分液化后，每份精液标本分装于16个1ml冷冻瓶，按4个不同时间段分别分四组进行：5、15、30、60min。

1.3.2每个冷冻瓶加入1mlHSPM冷冻保护液及0.2ml精液充分混匀，在室温（20℃～22℃）下放置不同时间，到时计算活力精子数。

1.4统计结果处理 所有的实验数据全部输入微机，使用SPSS11.5进行统计分析。

2 结果

2.1 HSPM作用前后及作用不同时间后的精子活力变化 充分液化后的新鲜精液与冷冻保护液HSPM作用4个不同时间段后，精子活力均有所下降，平均精子活力指数分别为：（0.360±0.231），（0.298±0.201），（0.313±0.222）及（0.248±0.119）。与新鲜精子的活力相比较，差异有统计学意义（P<0.01）。其中15min和60min下降非常明显，但30min后的精子活力又稍微有所回升。见表1。

2.2两种冷冻方法对精子活力的影响 缓冻法复温后的平均精子活力指数（0.181±0.134），高于速冻法的（0.141±0.105），差异有统计学意义（P<0.001）。两种冷冻方法结果均显示精子活力随着冷冻时间的延长而下降。见表2。

3 结果分析

精子冷冻保存包括被冷冻保护剂孵育、降温冷冻和超低温储存、水浴复温等过程[4]。这些物理化学效应直接作用于精子， 使其活力不可避免地受到一些影响。

为了尽量减少精子冷冻/复温后的活力损失，Polge首先使用甘油作为冷冻保护剂，目前IVF实验室采用以甘油为主的复合型配方[5]。冷冻保护剂的作用机制非常复杂，保护效应主要是与水分子形成氢键，改变水的正常晶体结构，缩小了水分子体积，减少了冻结水的量。

甘油分子量大、渗透性高，能插入精子膜的双层分子，诱导膜结构变化。通过-OH基团与水形成氢键，降低或阻止细胞内冰晶形成，起到了膜内保护剂的作用[6]。但甘油所具有的高渗透性，又很容易造成对精子的损伤。因为甘油能够干扰ATP合成与利用间的平衡，改变精子的生物能量状态，依赖离子的细胞反应过程的代谢控制会受到损害，发生不可逆的细胞损伤。因此，保护液中的甘油浓度是一个很重要的因素，当甘油浓度过低时防护效果差；而浓度较高时又具有细胞毒性，影响精子活力[7]。

本文欲研究冷冻保护剂与精子的作用时间对其活力的影响，结果表明：作用后的精子平均活力指数均较新鲜精子降低，其中15min和60min下降明显。原因可能是在作用的最初十几分钟内，甘油对质量不太好的精子具有较明显的负面影响。作用至30min时，精子活力下降趋势基本停止，甚至稍有回升，此时细胞的代谢活动与保护液达到了新的平衡。作用至60min时，因为长时间与保护液接触，甘油的高渗透性使精子膜受损，活力降低。实验表明HSPM保护液中的成分对精子活力有影响，精子与冷冻保存液的作用时间越长，活力受影响越严重。因此对于少精者，精子与HSPM充分混匀后，应加快冷存。而对于健康者的精子，30min是最好的作用时间。

复温时水流至细胞内造会成细胞膜破裂，此时的冰晶再形成又加重了冷冻时对细胞膜的损伤。所以，快速复温对冷冻精液的活力影响较小。

4 结论

新鲜精子与冷冻保护液HSPM作用后，由于甘油的高渗透性，精子其活力均有所下降，作用时间越长，活力下降越明显。因此，冷冻少精者的精液，应尽量缩短与冷冻保护液液的作用时间，将其摇匀后尽快进行冷冻处理。30min是精子细胞代谢活动与渗透作用达到平衡的阶段，质量好的精子活力达到最佳。对于健康者的精液，应让其与保护液作用30min再进行冷冻处理。

参考文献：

[1]黄荷凤.现代辅助生殖技术[M]. 北京人民军区出版社， 2013： l-6.

[2]Allen C， Keane D. A survey of irish consultants regarding awareness freezing and assisted reproduction[J]. Ir Med J， 2003， 96（l）： 23-25.

[3]Lahar-Baratz S，Koimfan M，Shiloh H. Analyzing a factors affecting the success rate of frozen-thawed embryos[J].J Assist report Gent， 2003， 2008（11）：444-448.

[4]张辉，张伟，朱辉，等. IL-1对冷冻复温人精子顶体反应的影响[J].哈尔滨医科大学学报， 2002， 36（5）：315-352.

[5]颜军昊，陈子江，李媛. 低温冷冻对人类精子影响的研究进展[J]. 山东医药， 2003， 43（24）：63-64.

[6]柯文鸿，姜宏，倪丰.4种精子冷冻液的比较[J]. 中国男科学杂志， 2003， 17（3）：182-183.

[7]向祖琼，胡明广，曹文雷. 两种冷冻保护剂对精子冷冻保护的效果比较[J]. 上海第二医科大学学报， 2006， 25（3） ：318-319.

编辑/哈涛