NO参与调节高浓度CO2诱导的番茄气孔关闭

王 欢， 肖文丹， 牛耀芳， 柴如山， 刘 秒， 章永松

(浙江大学环境与资源学院，环境修复与生态健康教育部重点实验室，杭州 310058)

NO参与调节高浓度CO2诱导的番茄气孔关闭

王 欢， 肖文丹， 牛耀芳， 柴如山， 刘 秒， 章永松*

(浙江大学环境与资源学院，环境修复与生态健康教育部重点实验室，杭州 310058)

【目的】高浓度CO2在促进植物光合作用的同时，也诱导了叶片气孔关闭。气孔关闭降低植物的蒸腾作用，有助于提高水分利用效率和耐旱性。本文研究了高浓度CO2对番茄气孔开度和保卫细胞中一氧化氮(NO)含量的影响，以及NO信号分子在高浓度CO2诱导番茄气孔关闭的信号转导机制中的作用。为了确定NO的酶催化途径，本试验检测了一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)和硝酸还原酶(nitrate reductase, NR)在高浓度CO2促进NO合成中的作用。【方法】本试验以番茄(SolanumlycocarpumL.)为研究材料，利用CO2培养箱(Conviron E7/2 growth chambers)提供不同CO2浓度的试验环境 (将培养箱中CO2浓度控制为350 μL/L或800 μL/L)，研究不同CO2浓度和试剂处理对番茄气孔开度和保卫细胞中NO含量的影响。采用NO特异性荧光探针DAF-FM DA检测番茄保卫细胞中NO的含量。DAF-FM DA与NO反应生成一种荧光物质DAF-2 T，根据其荧光强度的高低可以判断NO的相对含量。利用NOS抑制剂L-NAME和NR抑制剂钨酸盐(tungstate)，分别研究了NOS和NR在高浓度CO2促进NO合成中的作用。【结果】高浓度CO2处理6 h后，番茄气孔开度降至2.3 μm，较正常气孔开度降低了32%。NO荧光法检测发现，高浓度CO2处理导致保卫细胞的荧光强度显著增加，荧光强度升高了88%。当使用cPTIO清除NO后，保卫细胞中NO含量降低了35 %；气孔开度恢复至3.2μm，基本上达到正常浓度CO2处理下的气孔开度。在高浓度CO2下，200 μmol/L L-NAME处理导致气孔开度增加了30 %，保卫细胞中NO含量降低了33%；100 μmol/L钨酸盐处理导致气孔开度增加了35 %，保卫细胞中NO含量降低了40%。【结论】本文发现高浓度CO2显著提高保卫细胞中NO含量和诱导气孔关闭，清除NO后则明显抑制气孔关闭，表明NO在诱导气孔关闭过程中起重要作用。药理学实验显示，使用NOS抑制剂L-NAME和NR抑制剂钨酸盐均可显著降低NO含量和抑制气孔关闭，表明NOS和NR均参与了高浓度CO2诱导保卫细胞中NO的合成过程。因此，认为高浓度CO2通过NOS和NR路径促进保卫细胞中NO的合成，提高了保卫细胞中NO含量，从而诱导了番茄气孔关闭。

高浓度CO2； 气孔； 一氧化氮； 番茄； 一氧化氮合成酶； 硝酸还原酶

自18 世纪工业革命以来，由于人类燃烧化石燃料和大量砍伐森林的影响，大气CO2浓度不断升高，从工业革命前的270 μL/L上升到目前的350 μL/L，并且预测到本世纪末，大气CO2浓度将升高到730～1020 μL/L[1]。近期研究证明，大气CO2浓度升高可增强植物的光合作用[2]，促进侧根和根毛的形成[3-4]以及植物叶片的生长和发育等[5]，其中一个重要的方面是大气CO2浓度升高对植物气孔的密度、导度和运动等带来明显影响[6]。气孔是植物表皮上的微小孔隙，一般直接由两个豆状的保卫细胞组成。这两个细胞的端部相连，其中靠近气孔的细胞壁厚，伸缩性弱；远离气孔的细胞壁薄，伸缩性强。细胞中部之间的空隙是叶片内部与大气之间的通道[7]。事实上，多种环境因素可以引起植物气孔开度的变化，如水分亏缺、光照、湿度、疾病感染、CO2浓度等[8]。气孔开度的变化是植物平衡光合作用和水分利用效率的一种重要方式[9]。Betts等[5]指出高浓度CO2导致气孔开度减小，从而降低植物的蒸腾作用，可以使更多的水分留在土壤中，增强植物耐旱性。然而，高浓度CO2诱导植物气孔关闭的机理并不清楚。

众多证据显示，一氧化氮(NO)作为一种气体信号分子，在植物生理过程中发挥着重要作用，如植物的生长和发育[10-11]、气孔的运动[12]、植物对生物和非生物胁迫的响应等[13-14]。NO的多种功能源于其与众多信号途径密切相关，这些信号途径包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)、生长素(auxin)、水杨酸(salicylic acid, SA)、促有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Ca2+等[12, 15]。已有研究表明，脱落酸(ABA)通过调控保卫细胞中ROS、NO的合成与含量诱导气孔关闭[16-18]。在此过程中，ROS和NO均诱导了下游的钙离子信号，导致细胞质钙离子浓度[Ca2+]i升高。Prior等[19]研究发现，高浓度CO2显著增强植物对氮、磷、钾、钙、镁和微量元素铜、铁、锰、锌的吸收能力，从而提高保卫细胞中的[Ca2+]i浓度。作者在近期的研究中也发现，NO信号分子在高浓度CO2促进番茄侧根的发育和形成过程中起着重要作用[3]。因此推测，NO信号分子在高浓度CO2诱导气孔关闭过程中也可能发挥主要作用。然而，具体的信号传导过程和调控机理尚不清楚。

在生物体内，NO的合成途径有很多，包括酶催化途径和非酶催化途径，但在不同的生物体内和环境下，NO的来源有着显著差异。在动物体内，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是合成NO的主要来源，以L-精氨酸(L-arginine)为底物，在NADPH和氧存在条件下经过5个电子的氧化生成L-瓜氨酸(L-citrulline)和NO[20]。在植物体内，酶催化途径合成NO的主要酶包括NOS和硝酸还原酶(nitrate reductase，NR)，以及在某些植物的特定组织或器官或在特殊环境条件下存在的一氧化氮氧化还原酶(nitric oxide oxidoreductase，N-iNOR)和黄嘌呤氧化还原酶(xanthine oxidoreductase, XOR)[21]。虽然到现在还没有鉴定出植物NOS基因和酶蛋白的同源体，但使用动物NOS抑制剂仍能抑制NO的合成，说明在植物体内仍存在依赖L-精氨酸的NOS活性[22]。Corpas等[23]的研究证明，豌豆幼苗的叶片、茎和根中存在组成型NOS活性，并且不同的部位和发育阶段组成型NOS活性不同。Neill等[24]报道，ABA诱导的NO浓度升高在拟南芥气孔关闭中起重要作用，而且NO主要是通过NOS-like途径产生。Guo等[25]运用转基因技术将T-DNA插入到AtNOS1内构建atnos1突变体，证明了NOS对于线粒体中NO合成和ABA诱导气孔关闭是必需的。使用ABA处理叶片表皮后发现，与野生型相比，atnos1突变体中的ABA诱导气孔关闭和保卫细胞中NO含量升高均受到了强烈抑制。最近研究发现，高浓度CO2增强番茄根中NOS活性，从而促进了NO的合成和侧根的形成[3]。

在植物体内还存在另外一种催化NO合成的酶蛋白—硝酸还原酶(NR)。不管采用植物体内法还是体外法试验，NR均能利用NAD(P)H作为电子供体催化亚硝酸盐还原生成NO[12, 26]。Desikan等[17]运用拟南芥NR双突变体nia1nia2 (拟南芥nia1nia2突变体中NR酶活性不到野生型的1 %)研究发现，ABA不能诱导nia1nia2突变体保卫细胞中NO合成和气孔关闭，说明NR介导NO的合成是保卫细胞中ABA信号的重要步骤。Bright等[16]研究发现，NR抑制剂钨酸盐(如钨酸钠)抑制ABA和亚硝酸诱导的气孔关闭和NO产生。目前，关于高浓度CO2对NR酶活性的影响，以及NR在植物对高浓度CO2响应中的作用尚未形成一致的观点。一些学者认为，高浓度CO2增强了大车前草(Plantagomajor)和烟草(tobacco)体内的NR酶活性[27-28]；而Ferrario-Méry等[29]研究表明，高浓度CO2降低了小麦、玉米和烟草体内的NR酶活性。最近本课题组研究发现，高浓度CO2对番茄体内NR酶活性没有显著影响[3]。这种差异性可能与不同的植物品种、组织部分、发育阶段和生长条件等因素有关。

本文利用CO2培养箱(Conviron E7/2 growth chambers)提供不同CO2浓度的试验环境，研究了NO信号分子在番茄气孔对高浓度CO2响应中的作用以及NO来源，以期进一步揭示高浓度CO2诱导番茄气孔关闭的内在机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以番茄(SolanumlycocarpumL.)为研究材料。种子经灭菌消毒后，均匀撒于含0.8 %(w/v)琼脂和1.0%(w/v)蔗糖的全营养培养基上，然后在4℃黑暗下春化24 h后，将培养皿放在拟南芥培养室发芽。培养7 d后，挑选长相一致的壮苗移栽到1/2浓度的全营养液中培养14 d，选择长相一致的壮苗移栽至装有全营养液的黑色塑料烧杯中(约300 mL)。营养液的组成如下(μmol/L): H3BO310、 MnSO40.5、ZnSO40.5、 CuSO40.1、(NH4)6Mo7O240.1、 Fe-EDTA 25、 KH2PO4500、MgSO4500、 CaCl21000、 KNO31500。营养液pH值调节为5.8～6.0，每隔3 d更换一次。所有植物放在人工气候室内培养，室内植物生长条件为: 相对湿度为70%～80%，光照强度photons 200 μmol/L/(m2·s)，光照昼夜循环为白天10 h/夜晚14 h，白天/夜晚气温分别为22℃/20℃。继续培养14 d后，幼苗用于以下处理与测定。

1.2 气孔开度的测定

气孔开度的测定采用McAinsh等[30]方法，并作微小改动。撕下番茄叶片的下表皮并使其漂浮在3 mL MES缓冲液上。MES缓冲液组成为10 mmol/L MES-KOH、 5 mmol/ L KCl、 50 μmol/L CaCl2, 并维持pH为6.15不变。为了使气孔全部开放，表皮在22℃、 photon 200 μmol/L/(m2·s)光照条件下处理2 h。然后，放入不同浓度的CO2培养箱(Conviron E7/2 growth chambers)中，将培养箱中CO2浓度控制为350 μL/ L(正常浓度CO2)和800 μL/ L(高浓度CO2)两个水平。在不同CO2浓度下，使用下列试剂单独或复合处理下表皮: 200 μmol/ L NO清除剂cPTIO[2-(4-carboxyphenyl)-4,4，5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide]; 100 μmol/ L NO供体SNP(sodium nitroprusside); NOS抑制剂L-NAME; NR抑制剂钨酸盐(tungstate)，其中L-NAME和钨酸盐的浓度通过试验确定。6 h后，使用带数码照相机的光学显微镜观察气孔大小并拍照。使用ImageJ软件分析照片，测量气孔开度。为了避免昼夜节律作用对气孔运动的影响，所有试验处理均在相同的时间段内进行。每个处理重复6次，每次测量8～10个气孔。

1.3 保卫细胞中NO含量的测定

本试验使用NO特异性荧光探针DAF-FM DA(4-amino-5-methylamino-2’,7’-difluorofluorescein diacetate)测定保卫细胞中NO含量[31]。撕下番茄叶片下表皮放在含10 μmol/L DAF-FM DA的MES缓冲液(pH 6.15)中，在黑暗中处理30 min后，用不含染色剂的MES缓冲液清洗下表皮除去多余的染色剂。在正常浓度CO2或者高浓度CO2培养箱中经不同处理6 h后，使用激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope, CLSM)检测荧光物质的荧光强度，激发光和发射光的波长分别为488和515 nm。使用显微镜上的数码照相机拍摄荧光照片，并用ImageJ软件分析荧光强度。荧光强度用相对光强单位表示，范围为0～255。

1.4 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel(2007)和SPSS 18.0统计软件进行统计分析，LSD法比较不同处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 高浓度CO2对番茄气孔关闭的诱导作用

Webb等[32]报道，CO2浓度升高诱导鸭跖草保卫细胞中[Ca2+]i浓度升高，从而诱导气孔关闭。笔者通过测定高浓度CO2不同处理时间下气孔开度的变化，在番茄中也发现了类似的气孔关闭现象。从图1可以看出，高浓度CO2处理番茄下表皮2 h后，气孔开度由3.2 μm降低至2.7 μm，下降了16%，达到显著水平(P<0.05)。高浓度CO2处理6 h后，气孔开度达到最小为2.3 μm，较正常气孔开度降低了32 %，随后气孔开度略有升高。因此，在以后的试验中，正常浓度CO2和高浓度CO2的处理时间均采用6 h。本试验结果表明，高浓度CO2处理诱导了番茄气孔关闭，显著降低气孔开度。植物气孔关闭可以降低蒸腾作用，增强植物的耐旱性，提高水分利用效率。

2.2 NO在高浓度CO2诱导气孔关闭中的作用

[注(Note): A表示CO2浓度为350 μL/L Indicate 350 μL/L CO2treatment; E表示CO2浓度为800 μL/L Indicate 800 μL/L CO2treatment.]

已有研究表明，NO信号分子在ABA诱导气孔关闭过程中起着重要作用[11]。为了研究NO在高浓度CO2诱导气孔关闭过程中的作用，本试验采用了NO供体SNP和NO清除剂cPTIO调节番茄保卫细胞中NO水平。如图2所示，正常浓度CO2处理下，在缓冲液中加入SNP后导致气孔开度降低至2.1 μm，降低了38 %。高浓度CO2处理下，在缓冲液中加入cPTIO清除保卫细胞中NO后，气孔开度恢复至3.2 μm，基本上达到正常浓度CO2处理下的气孔开度，表明cPTIO通过清除NO抑制了高浓度CO2诱导的气孔关闭。在缓冲液中同时加入SNP后，气孔开度降低至2.4 μm，表明SNP解除了cPTIO的抑制作用，恢复了高浓度CO2诱导气孔关闭的调控。由此可以推断NO信号分子参与了高浓度CO2诱导番茄气孔关闭的过程。

为了直接检验NO在高浓度CO2诱导气孔关闭过程中的作用，本试验使用了NO荧光探针DAF-FM DA测定保卫细胞中NO的相对含量。DAF-FM DA与NO反应生成一种荧光物质DAF-2 T，根据其荧光强度的高低可以判断NO的相对含量。在正常浓度CO2处理下，SNP水溶液释放NO显著提高了保卫细胞的荧光强度，荧光强度增加了119%(图2)。与正常浓度CO2处理相比，高浓度CO2处理导致保卫细胞的荧光强度显著增加，荧光强度升高了88%。当使用cPTIO清除NO后，保卫细胞的荧光强度显著降低了35%。然而，cPTIO对NO的清除作用可大部分被SNP解除。因此认为，高浓度CO2处理增强了保卫细胞合成NO的能力，提高了保卫细胞中NO含量，从而诱导番茄气孔关闭。

2.3 NOS参与高浓度CO2促进保卫细胞NO合成的过程

[注(Note): A表示CO2浓度为350 μL/L Indicate 350 μL/L CO2treatment; E表示CO2浓度为800 μL/L Indicate 800 μL/L CO2treatment; S表示SNP Indicate SNP treatment; C表示cPTIO Indicate cPTIO treatment.柱上不同小写字母表示不同处理间差异达到5%显著水平 Different lowercases above the bars indicate significantly different at 5% level between different treatments.]

在植物体内，NOS是组成型NO合成路径中重要的催化酶之一。本试验利用NOS抑制剂L-NAME检测了NOS在高浓度CO2促进保卫细胞NO合成中的作用。图3为在高浓度CO2下不同L-NAME浓度处理对气孔开度影响的结果，从中可以看出，当L-NAME浓度为200 μmol/L时，高浓度CO2诱导的气孔开度恢复至3.0 μm，达到最大水平。因此，在之后的试验中，L-NAME浓度均采用200 μmol/L。

在高浓度CO2下，L-NAME处理导致气孔开度增加了30 %，保卫细胞荧光强度降低了33 %(图4)。然而在正常浓度CO2下，L-NAME处理对气孔开度没有显著影响，对保卫细胞荧光强度影响较小。此外，SNP处理可以消除L-NAME对高浓度CO2诱导气孔关闭和NO含量升高的抑制作用。此结果表明，NOS参与了高浓度CO2促进番茄保卫细胞NO合成的过程。

2.4 NR参与高浓度CO2促进保卫细胞NO合成的过程

在植物体内，NR是组成型NO的合成路径中另一种重要的催化酶。本试验利用NR抑制剂钨酸盐研究了NR在高浓度CO2促进保卫细胞NO合成中的作用。图5结果表明，不同浓度钨酸盐处理均可不同程度地恢复高浓度CO2处理的气孔开度，当钨酸盐浓度为100 μmol/L时，高浓度CO2诱导的气孔开度恢复至3.1 μm，达到最大水平。因此在之后的试验中，钨酸盐浓度均采用100 μmol/L。

在高浓度CO2下，钨酸盐处理导致气孔开度增加了35%，保卫细胞荧光强度降低了40%，并且添加SNP可以消除钨酸盐的抑制作用。在正常浓度CO2下，钨酸盐处理并没有对气孔开度和保卫细胞荧光强度产生显著影响(图6)。通过分析以上试验结果，可以看出NR在高浓度CO2促进番茄保卫细胞NO的合成过程中也起着重要作用。

[注(Note): A表示CO2浓度为350 μL/ L Indicate 350 μL/L CO2treatment; E表示CO2浓度为800 μL/L Indicate 800 μL/L CO2treatment; L100, L200, L300, L400表示L-NAME的浓度分别为100, 200, 300, 400 μmol/L Indicate 100, 200, 300, 400 μmol/L L-NAME treatment, respectively. 柱上不同小写字母表示不同处理间差异达到5%显著水平Data with different lowercases above the bars indicate significantly different at 5% level between different treatments.]

3 讨论与结论

[注(Note): A表示CO2浓度为350 μL/L Indicate 350 μL/L CO2treatment; E表示CO2浓度为800 μL/L Indicate 800 μL/L CO2treatment;L表示L-NAME Indicate L-NAME treatment; S表示SNP Indicate SNP treatment. 柱上不同小写字母表示不同处理间差异达到5%显著水平 Different lowercases above the bars indicate significantly different at 5% level between different treatments.]

[注(Note): A表示CO2浓度为350 μL/L Indicate 350 μL/L CO2treatment; E表示CO2浓度为800 μL/L Indicate 800μL/L CO2treatment; T50, T100, T150, T200表示钨酸盐的浓度分别为50, 100, 150, 200 μmol/L Indicate 50, 100, 150, 200 μmol/L tungstate treatment, respectively. 柱上不同小写字母表示不同处理间差异达到5%显著水平 Data with different lowercases above the bars indicate significantly different at 5% level between different treatments.]

二氧化碳(CO2)作为植物光合作用的主要底物,其在大气中的浓度变化会对植物生长发育产生重大的影响。随着大气中CO2浓度不断升高，越来越多的学者开始关注和研究大气CO2浓度升高对植物的影响以及植物的响应机理。在这些研究领域中，植物气孔对大气CO2浓度升高的响应是一个重要方面。大量研究表明，大气CO2浓度升高显著影响植物的气孔发育、下表皮气孔密度、气孔指数、气孔功能和气孔运动等方面[6, 8, 33-35]。例如，大气CO2浓度升高可以显著降低植物气孔开度[6, 33, 36]。Jarvis等[33]研究指出，尽管大气CO2浓度升高诱导气孔关闭，但胞间CO2浓度仍略有升高有利于植物进行光合作用。另一方面，气孔开度的缩小可以降低植物的蒸腾作用，显著提高水分利用效率。因此，大气CO2浓度升高可以增强植物的光合作用以及对水胁迫的耐性。本文研究发现，高浓度CO2显著降低番茄的气孔开度。高浓度CO2处理6 h后，与正常浓度CO2相比，气孔开度降低了32%(图1)。本试验结果与许多研究者的高浓度CO2诱导拟南芥、依兰(CedrellaOdorata.)和鸭跖草(Commelinacommunis)气孔关闭的结论一致[32-33, 36]。

一氧化氮(NO)信号分子在植物的生长发育[10-11]、气孔运动[12]、环境胁迫响应等生理过程中发挥重要作用[13-14]。近年来，一些学者已经关注到高浓度CO2对植物体内NO含量的影响以及NO在响应过程中的作用。Jin等[37]研究发现，缺铁和高浓度CO2复合处理促进番茄根中NO的合成，增强了番茄对缺铁的耐性。最近我们也发现，高浓度CO2提高了番茄根中的NO含量，从而促进番茄侧根的形成和侧根数量的增加[3]。大气CO2浓度升高可以显著增强植物的光合作用，促进蔗糖合成。Kelly等[38]研究发现，蔗糖通过己糖激酶(糖信号路径中的一种糖磷酸化酶)诱导NO合成和气孔关闭。本文研究发现，SNP处理导致保卫细胞中NO含量提高了119%，同时气孔开度降低了38%(图2)。与正常浓度CO2处理相比，高浓度CO2诱导保卫细胞中NO含量增长88%，气孔开度降低了32%。使用NO清除剂cPTIO后，高浓度CO2诱导的NO含量增长和气孔关闭均受到强烈抑制。研究结果表明，高浓度CO2提高了番茄保卫细胞中NO含量以及NO在高浓度CO2诱导气孔关闭过程中起着重要作用。本研究结果也再次验证了前人的结论，即NO信号分子诱导气孔关闭以及NO浓度与气孔开度大小呈负相关关系。

[注(Note): A表示CO2浓度为350 μL/L Indicate 350 μL/L CO2treatment; E表示CO2浓度为800 μL/L Indicate 800 μL/L CO2treatment. T表示钨酸盐Indicate tungstate treatment, S表示SNP Indicate SNP treatment. 柱上不同小写字母表示不同处理间差异达到5%显著水平 Different lowercases above the bars indicate significantly different at 5% level between different treatments.]

目前，已有一些学者研究高浓度CO2诱导植物气孔关闭的调控机理，但具体的调控路径和信号分子并不清楚。Ainsworth等[39]通过电生理学实验发现，升高CO2浓度能够激活K+外流通道和S型阴离子通道，刺激保卫细胞中Cl-的释放并且提高保卫细胞中Ca2+的浓度。这些变化总体导致膜电位去极化，从而使气孔关闭。Prior等[19]和Webb等[32]研究发现，高浓度CO2促进植物对钙离子的吸收，提高保卫细胞中[Ca2+]i浓度。[Ca2+]i在气孔对高浓度CO2响应中起着重要作用，降低[Ca2+]i浓度可以强烈抑制高浓度CO2诱导的气孔关闭[36]。在拟南芥和菠菜保卫细胞中，[Ca2+]i作为NO信号转导路径上游或下游的信号分子诱导气孔关闭[40-41]。此外，Bright等[16]发现，ABA促进拟南芥保卫细胞中NO的合成和诱导气孔关闭依赖于过氧化氢(H2O2)信号路径。ECS1(对环境CO2浓度敏感的拟南芥突变体)参与调节CO2诱导的拟南芥气孔关闭和H2O2积累[42]。因此，在高浓度CO2诱导气孔关闭过程中，NO、[Ca2+]i和ROS等信号分子之间的对话值得进一步研究。

在植物体内，NOS和NR是两种主要的参与组成型NO合成的催化酶[21]。Neill等[24]报道了ABA诱导的NO浓度升高在拟南芥气孔关闭中起着重要作用，而且NO主要是通过NOS-like途径产生。Guo等[25]运用atnos1突变体证明了NOS对于线粒体中NO合成和ABA诱导气孔关闭是必需的。本文研究发现，L-NAME显著抑制高浓度CO2诱导的番茄保卫细胞中NO合成和气孔关闭，添加SNP复合处理后可以清除该抑制作用(图4)。研究结果表明，NOS在高浓度CO2诱导番茄NO合成和气孔关闭过程中起着重要作用，该结论和Neill等[24]观点一致。最近研究还发现，高浓度CO2增强番茄根中NOS的活性，从而促进了NO的合成和侧根的形成[3]。另一方面，NR催化合成的NO在植物气孔对ABA响应过程中发挥重要作用[16-17]。本文研究发现，钨酸盐显著抑制高浓度CO2诱导的番茄保卫细胞中NO合成和气孔关闭，添加SNP复合处理后可以清除该抑制作用(图6)，表明NR参与了高浓度CO2诱导的番茄保卫细胞中NO合成。本文研究结果与Geiger等[28]的结论一致;Geiger等[28]发现高浓度CO2增强了烟草叶片内NR酶活性和NO合成。然而，Ferrario-Méry等[29]研究表明高浓度CO2降低了小麦、玉米和烟草体内NR酶活性。最近本课题组也发现，高浓度CO2对番茄根内NR酶活性没有影响。这种差异性可能与不同的植物品种、组织部分、发育阶段和生长条件等因素有关。从以上研究结果我们可以看出，NOS和NR均参与了高浓度CO2促进番茄保卫细胞NO的合成，进而诱导气孔关闭过程。

本研究证明，高浓度CO2诱导番茄保卫细胞NO浓度升高，从而导致气孔关闭。在该响应中，NOS和NR均参与了高浓度CO2促进保卫细胞NO的合成过程。因此笔者认为，NOS和NR催化产生的NO在高浓度CO2诱导番茄气孔关闭中起着重要作用。该结果将为进一步理解高浓度CO2诱导植物气孔关闭的信号转导路径机制提供一种新的思路。

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Nitric oxide is involved in the induced stomatal closure of tomato by high level of carbon dioxide

WANG Huan, XIAO Wen-dan, NIU Yao-fang, CHAI Ru-shan, LIU Miao, ZHANG Yong-song*

(MinistryofEducationKeyLaboratoryofEnvironmentRemediationandEcosystemHealth/CollegeofEnvironmentalandResourceScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

【Objectives】Elevated CO2has been shown to play a role in enhancing the photosynthesis of plants, and induce stomatal closure of leaf. Stomatal closure significantly decreases plant transpiration, and contributes to enhanced water use efficiency and resistance to water stress. The effect of elevated CO2on the aperture of stomata, the level of nitric oxide(NO)in guard cells and the role of NO in CO2elevation-induced stomatal closure in tomato(SolanumlycocarpumL.)were examined. In order to identify the enzymatic source of endogenous NO in guard cells, the role of nitric oxide synthase(NOS)and nitrate reductase(NR)in the CO2elevation-induced NO accumulation was investigated. 【Methods】 Tomato(SolanumlycocarpumL.)was used as experimental material. In E7/2 growth chambers, CO2treatments and/or pharmacological experiment were initiated by treating stomata at a concentration of either 350 or 800 μL/L. Then, the stomatal aperture and NO level in guard cells were measured. The levels of NO in guard cells of tomato were determined using the cell NO-specific fluorescent probe. NO levels in guard cells were measured based on the intensity of fluorescence. NOS inhibitor L-NAME and NR inhibitor tungstate were used to assess the role of NOS and NR in the CO2elevation-induced NO production, respectively. 【Results】 The present study showed that the stomatal aperture decreased to 2.3 μm after 6 hours of elevated CO2treatment, and decreased by 32% related to ambient CO2treatment. The intensity of green fluorescence showed that the level of NO in guard cells were 88% higher under elevated CO2than that under ambient CO2. CO2elevation-induced stomatal closure was reversed by treatment with NO scavenger cPTIO, the level of NO in guard cells decreased by 35% and the stomatal aperture increased to 3.2 μm, similar to those under ambient CO2. Under elevated CO2, addition of 200 μmol/L L-NAME increased the stomatal aperture by 30%, and decreased NO accumulation in guard cells by 33%; while addition of 100 μmol/L tungstate increased the stomatal aperture by 35% and NO accumulation in guard cells decreased by 40%. 【Conclusions】 Elevated CO2significantly increased the level of NO in guard cells and decreased aperture of stomata compared to ambient CO2. CO2elevation-induced stomatal closure was reversed by scavenging NO, indicating that NO plays an important role in the induced stomatal closure of tomato by CO2elevation. The pharmacological evidences showed that both NOS inhibitor L-NAME and NR inhibitor tungstate significantly decreased NO accumulation in guard cells and inhibited stomatal closure under elevated CO2, suggested that both NOS and NR were involved in CO2elevation-induced NO accumulation. Therefore, it seems to be concluded that elevated CO2promotes the production of NO through both NOS and NR, and increases the level of NO in guard cells, and induces stomatal closure in tomato.

elevated CO2; nitric oxide; nitrate reductase; nitric oxide synthase; stomata; tomato.

2014-08-01 接受日期: 2014-11-20 网络出版日期: 2015-05-20

国家支撑计划项目(2012BAC17B02)；浙江省团队科技特派员项目(2012T2T209)资助。

王欢(1987—)，男，安徽宿州人，博士研究生，主要从事植物营养生理研究。E-mail: whna1999@gmail.com *通信作者E-mail: yszhang@zju.edu.cn

S641.2.601

A

1008-505X(2015)05-1243-09