PCR技术在结核病诊断中的价值

卞永娟136000吉林省四平市结核病医院检验科

PCR技术在结核病诊断中的价值

卞永娟
136000吉林省四平市结核病医院检验科

目的：探讨PCR技术在结核病诊断中的价值。方法：收治结核病患者282例，分析其临床资料，同时与浓缩集菌涂片法进行对比。结果：PCR法的阳性率明显高于浓缩集菌涂片法（χ2=12.397，P＜0.05）。检测中发现，浓缩集菌阳性的标本，PCR法也均为阳性，敏感度100％。结论：PCR技术在结核病诊断中具有重要的价值。

结核病；PCR技术；诊断

结核病是世界范围内日益严重的公共卫生问题之一，是由结核分枝杆菌所致的以呼吸系统感染为主的慢性传染病，发病率与致死率均较高。该病可累及全身各个系统，临床表现多种多样，尤其是肺外结核往往十分隐匿，给临床诊断带来极大的困难。实验室检测是结核病诊断、治疗及预防控制的重要依据，是消灭结核病传染源、切断传播途径、控制流行的重要环节［1-5］。现对我院2014年1月-2015年3月住院确诊的结核病患者282例的临床资料进行统计分析，同时与浓缩集菌涂片法进行对比，探讨PCR技术在结核病诊断中的临床价值。

资料与方法

2014年1月-2015年3月收治结核病患者282例，男155例，女127例，年龄12～86岁，平均（35.4±6.5）岁。结核病诊断标准：肺结核的诊断符合中华医学会结核病学分会制定的《结核病诊断指南》中肺结核诊断标准。肺外结核：①有肺结核慢性中毒症状，如发热、盗汗、消瘦等；②PPD实验强阳性或血抗结核抗体≥2项阳性；③痰结核杆菌培养阳性；④影像学检查具有符合结核病的特征；⑤诊断性试验抗结核治疗有效。取患者的临床标本进行检测，其中痰液240例，胸腹水26例，脑脊液16例。

方法：浓缩集菌涂片法先集菌后检查，可提高检出率。脑脊液和胸、腹水无杂菌，可直接离心沉淀集菌。处理后的材料再离心沉淀。取沉淀物做涂片染色镜检。应用PCR法检测标本中结核分枝杆菌的方法可分2个步骤：结核分枝杆菌DNA的提取、PCR扩增和扩增产物的检测。①标本DNA的提取：标本加2～3倍体积的4％NaOH液化、离心、沉淀，加入50μL DNA提取液，煮沸10 min，离心5min，取上清液5μL待用。②PCR扩增和扩增产物的检测：Tap酶0.5μL加15.5μL反应液充分混匀后加石蜡油20μL封顶，再加入4μL标本DNA提取液，离心后在扩增仪中扩增，93℃45 s，55℃45 s，72℃1min，持续35个循环，然后72℃5min。之后将上清液5μL加入扩增后的反应管中，充分混匀后取下层蓝色液体15μL。电泳25min后在紫外检测仪上观察。若在227 bp处显现橙黄色色带，提示结核杆菌阳性。

统计学处理：采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行处理，计量资料比较采用t检验，计数资料以％表示，比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

用PCR法对282例临床标本中的结核杆菌进行快速检测，同时与浓缩集菌涂片法结果进行比较，PCR法的阳性率明显高于浓缩集菌涂片法（χ2=12.397，P＜0.05）。检测中发现，浓缩集菌阳性的标本，PCR法也均为阳性，敏感度100％。见表1。

讨论

结核病是严重危害人们健康的传染病之一，涂片法和改良罗氏培养法一直以来是传统检测方法，但涂片法特异性差、阳性率低、敏感性低。培养法所需时间长，一般需要3～8周，且感染者早期不易检出病菌，严重影响疾病的正确诊断［6］。PCR是一种体外酶促扩增特异DNA片段技术，是以目的基因为模板，利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物进行的DNA体外合成反应。PCR技术在结核病细菌学诊断上的敏感、快速的特点在多数报道中得到了肯定［7-9］。本组试验也充分表明，PCR法的阳性率明显高于浓缩集菌涂片法。检测中同时发现，浓缩集菌阳性的标本，PCR法也均为阳性，敏感度100％。目前，在经典PCR技术的基础上，各种新的适用于不同目的的PCR方法不断出现，已经发展了多种适用于各种场合和需求的PCR方法。依据MTB重复序列、蛋白质编码基因或rRNA基因设计的特异引物，通过PCR技术可从多种临床标本（如胸腔积液、脑脊液）中检测出结核分枝杆菌DNA。且PCR扩增的拷贝数越多，灵敏度就越高。因此，可检测1～100 fg纯化的结核分枝杆菌DNA，相当于1～20个结核分枝杆菌，而且用时只需1～2 d。与传统方法相比，如常规抗酸染色，每1mL痰液需含5 000个以上菌才能检出，且非结核分枝杆菌或其他细菌、孢子等抗酸染色亦为阳性。培养法需3～8周，而且必须是活菌。由此可见，PCR检测的阳性率明显高于常规细菌学方法。即使在试管内难以生长的少量菌，甚至死菌释放的未降解的DNA也能检测出来。这对于培养及涂片均为阴性的结核病患者的早期诊断与鉴别诊断，以及化疗后排菌情况的观察是很有益的。

Value of tuberculosis laboratory PCR in the diagnosis of tuberculosis

Bian Yongjuan
DepartmentofLaboratory ofTuberculosis Hospital in Siping City,Jilin Province 136000

Objective：To discuss the value of PCR in the diagnosis of tuberculosis.Methods：282 patientswith tuberculosiswere selected.We analyzed the clinical data and compared the concentration of smear technique.Results：The positive rate of PCR was significantly higher than that of condensingmethod（χ2=12.397，P＜0.05）.In the detection,condensing bacteria samples were positive,PCRwere positive,and the sensitivitywas100％.Conclusion：PCR playsan important role in the diagnosisof tuberculosis. Key words Tuberculosis；PCR technology；Diagnosis

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.24.77