(2R,3R)－丁二醇脱氢酶的体外重组表达

【摘要】目的　明确2，3-丁二醇脱氢酶（2，3-BDH）如何具有不同的立体定向性。方法　从枯草芽孢杆菌中克隆出（2R，3R）-丁二醇脱氢酶基因，将克隆的目的基因导入pMD18-T载体中，构建的重组质粒经测序后，将本实验序列和已发表序列进行比对分析，构建进化树。结果 重组质粒可在重组菌中获得可溶性表达。结论 利用重组菌株诱导表达获得了（2R，3R）-丁二醇脱氢酶。

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2015.24.131

作者单位：116024 大连理工大学

Recombinant Expression of（2R，3R）-Butanediol Dehydrogenase in Vitro

LUO Yajing YAN Taotao Dalian University of Technology，Dalian 116024，China

【Abstract】

Objective To establish how 2，3-BDH possesse differential stereo specificities. Methods The gene of（2R，3R）-BDH amplified from the genome of Bacillus subtilis，and was inserted into pMD18-T vector for sequencing. The constructed recombinant expression vector was sequenced， and the result of this experiment was compared with the known sequence to construct evolutionary tree. Results Soluble expression of the recombinant plasmid was obtained in the recombinant bacteria. Conclusion　（2R，3R）-BDH was obtained by induced expression in recombinant bacteria.

【Key words】　（2R，3R）-butanediol dehydrogenase，Gene clone，Soluble expression，Enzyme activity，Sequence analysis

众所周知，2，3-丁二醇（2，3-BD），3-羟基丁酮（acetoin，AC），丁二酮（diacetyl，DA）是微生物糖类代谢过程中的产物，广泛应用于食品生产，化妆品，燃料，航空航天和制药领域。

生物体中2，3-丁二醇的合成途径包括三种关键酶：α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶和2，3-丁二醇脱氢酶。其中，2，3-BDH催化了这三种代谢产物之间的NAD ＋/NADH依赖的氧化还原反应，且该酶具有底物和产物手性选择性。

天然存在的很多种属的微生物均可以表达（2R，3R）-丁二醇脱氢酶，但是这些微生物表达的（2R，3R）-丁二醇脱氢酶催化的产物都不是单一的，实际工业生产中我们想得到单一产物。因此，克隆（2R，3R）-丁二醇脱氢酶基因并在原核表达系统中进行表达不失为解决产物不单一问题的有效方法。将引入两个酶切位点的（2R，3R）-丁二醇脱氢酶基因插入表达载体pET-28a（+）中，并转化至大肠杆菌BL21-Gold（DE3）中，通过卡那霉素抗性基因筛选重组菌株，通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，收集菌体，利用超声破碎方法破碎，离心后得到细胞破碎上清液，测定上清液的粗酶酶比活力。

1　方法

1.1　BDH基因PCR扩增

取2%接种实验室保藏的枯草芽孢杆菌，活化后平板划线挑去单个菌落培养9～10 h后利用试剂盒提取基因组。设计引物，对目的片段BDH基因序列进行PCR扩增。设计上游引物 ydjL-F：CCC

GGATCC

CATGAAGGCAGCAAGATG （下划线为BamHI酶切位点，5’端为保护碱基），下游引物 ydjL-R：CCG CTCGAG GTTAGGTCTGACAAG （下划线为Xho I酶切位点，5’端为保护碱基）。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并通过DNA Gel Extraction Kit切胶回收PCR产物。

1.2　胶回收片段与pMD18-T连接测序

根据胶回收后目的片段的浓度，计算出载体与目的片段的比例，将胶回收片段与pMD18-T在16℃下过夜连接，命名构建的质粒为pMD18-BDH，将质粒用热激法至制备好的E.coil DH5α感受态细胞（100 μl）中。挑选出已转入质粒的白色菌落，接种于5 ml LB液体培养基中，37℃培养8～10 h。

利用质粒小量提取试剂盒提取质粒，并将提取的质粒送至TaKaRa公司测序。

1.3　pET-28a-BDH重组质粒构建

测序结果无误，将BDH PCR产物及pET-28a（+）用限制性内切酶BamH I、Xho I进行双酶切，37℃过夜，将100 μl酶切体系进行电泳，试剂盒回收酶切产物，回收后电泳定量 ［1］。

根据切胶回收得到的BDH PCR产物及pET-28a（+）的浓度，按照目的片段与载体物质量比3：1～6：1设计连接体系，16℃连接过夜，得到重组质粒，命名为pET-28a-BDH。

利用热激法将pET-28a-BDH重组质粒转化至E.coil BL21-Gold（DE3）感受态细胞。用TaKaRa质粒提取试剂盒提取质粒，电泳定量。对所提取的质粒进行PCR及双酶切验证，将阳性质粒送至TaKaRa测序，测序结果无误，可进行重组表达。将重组菌命名为ydjl-gold。

1.4　重组蛋白诱导表达

用灭菌后的LB液体培养基作为空白，在分光光度计上调零。用分光光度计测定一定间隔时间的OD 550，以时间为横坐标，以OD值为纵坐标，得到细菌在该培养条件下的生长曲线。

将带有pET-28a-BDH重组质粒的菌种ydjl-gold 进行活化，根据生长曲线培养菌体3 h左右使其OD 550＝1.0。取出1 ml发酵液保存。取出三角瓶，用水冷却，加入IPTG，终浓度为0.5 mmol，培养16～20 h，取出1 ml发酵液保存 ［2］。

收集培养液，5 000 g，4℃离心30 min弃上清。取100 μl保存。加入适量缓冲A液使菌体重悬。在冰浴条件下超声破碎菌体10 min（破碎条件：振幅50%，周期：0.35）。4 000 g，4℃离心30 min，收集上清。

对收集产物进行SDS-PAGE蛋白电泳，所用Marker为：Premixed Protein Marker（broad），蛋白大小约为40.01 kDa。

2　结果

2.1　重组质粒可在重组菌中获得可溶性表达

分别取ydjl-gold诱导前，诱导后的菌液，加上样缓冲液，沸水煮样10 min，制成电泳样品。制作12%分离胶和浓缩胶，待胶凝固后拔下梳子，将样品加入上样孔中，110 V电泳110 min，随后用染色液染色，再脱色，染色分为两种方法：（1）快速染色脱色法。导入染色液后微波炉中火加热30 min，倒出染色液，换脱色液微波炉中火再加热15 min。（2）传统染色法。倒入染色液后摇床震荡过夜，加脱色液脱色。得到SDS-PAGE蛋白电泳图显示，在Marker的44.3 kDa所对应的条带处有明显条带，与目标蛋白亚基大小符合 ［3-4］。

2.2　实验所得基因与芽孢杆菌属的同源性较高

实验进化树显示ydjl-gold与Paenibacillus polymyxa的亲缘关系最近，然后是Bacillus cereus ATCC 14579，这进一步说明实验所得基因来自于芽孢杆菌属，与芽孢杆菌属的同源性较高。另外，可以看出枯草芽孢杆菌中BDH基因和Klebsiella pneumoniae的同源性较差，主要原因是Klebsiella pneumoniae中的meso-2，3-Butanediol Dehydrogenase属于SDR家族。而曾有研究表明R，R-BDH可以从meso-BDH演变而来。

3　讨论与展望

本文以枯草芽孢杆菌为出发菌株，通过PCR获得相应（2R，3R）-丁二醇脱氢酶基因，构建了pET-28a-BDH重组质粒，并将其转化至E.coil BL21-Gold（DE3）中，通过卡那霉素抗性基因筛选得到重组质粒。利用重组菌株诱导表达获得了（2R，3R）-丁二醇脱氢酶，还可以通过以下方面进一步研究。

（1）利用圆二色谱及微量等温滴定技术，解析（2R，3R）-丁二醇脱氢酶二级结构和热力学常数。

（2）利用分子对接软件预测（2R，3R）-丁二醇脱氢酶与底物（2R，3R）-BD 和meso-BD 的结合模式；利用分子动力学模拟软件，MM/GBSA的方法计算不同突变体与底物结合能，指导实验确定定点突变 ［5］。

（3）利用定点突变的基因工程手段，原核表达突变体，重点表征突变体的酶相对活力参数、热稳定性和底物手性的选择性。理性选择出活性高、稳定性高、底物选择性好的丁二醇脱氢酶。