猪瘟病毒增殖特性研究进展

张玉杰，徐璐，张乾义，王琴

(中国兽医药品监察所，北京100081)



猪瘟病毒增殖特性研究进展

张玉杰，徐璐，张乾义，王琴*

(中国兽医药品监察所，北京100081)

从猪瘟病毒在体内外的增殖特性、病毒蛋白在RNA复制中的作用两个方面对猪瘟病毒的增殖规律进行了阐述，以期为猪瘟病毒致病机理的研究提供参考。

猪瘟病毒；增殖特性；复制

猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员之一,为单股正链RNA病毒，基因组大小约为12.3 kb，由5’-非编码区(5’-UTR)、一个开放阅读框(ORF)和3’-非编码区(3’-UTR)三部分组成。CSFV基因组编码一个由3898个氨基酸组成的多聚蛋白，之后被蛋白酶在信号肽处切割成4个结构蛋白，由丝氨酸蛋白酶介导切割成8个非结构蛋白。参与复制的CSFV蛋白根据参与复制的重要性不同，CSFV的基因可以分为复制必需基因和复制非必需基因。其中基因E0、E1、E2在病毒的脱衣壳与入核阶段起到了重要的作用，而基因NS5A和NS5B在CSFV的复制过程中扮演着十分重要的角色。CSFV在高尔基体和内质网中装配成熟后，成熟的感染性颗粒释放到细胞外来完成CSFV完整的生活周期，而核衣壳C蛋白则在病毒的包装功能上发挥着重要的作用。

病毒的生活周期包括病毒与细胞受体的吸附、病毒的变形内化、入胞、细胞内的再定位、病毒脱衣壳、入核、复制、包装和释放等过程[1]。其中，从病毒粒子的消失开始，到产生新的子代病毒粒子为止为病毒感染的隐蔽期，而隐蔽期又是病毒增殖过程中的主要阶段[2]。本文对CSFV的生活周期进行了介绍，同时从CSFV在体内外的增殖特性以及病毒在RNA复制中的作用两个方面对猪瘟病毒的增殖规律进行了详细的阐述。

1 CSFV的生活周期

CSFV可在猪的骨髓、睾丸、肺、脾和肾的细胞培养物及白细胞中繁殖，却不使细胞发生病变[3]。研究表明，CSFV在感染过程中首先与宿主细胞表面受体结合，通过其表面的E1和E2糖蛋白介导着与宿主细胞接触，开启CSFV的生活周期[4]，之后病毒与靶细胞表面的糖蛋白在一个低pH值的酸性环境下进行膜融合过程[4-5]，病毒的核酸从核衣壳释放到细胞质中。一方面利用细胞的起始因子和核糖体以RNA为模板合成一个大分子多聚蛋白，然后被切割成12个成熟蛋白，当病毒蛋白合成完成后就启动RNA复制[6]；另一方面以病毒RNA为模板，在RNA依赖性RNA聚合酶的作用下合成负链，即形成了正链与负链共价连接的双链RNA中间复合体，然后再合成正链。在细胞蛋白和病毒非结构蛋白的作用下，从宿主细胞中释放出由核衣壳C蛋白包裹着的成熟且有感染性的颗粒。至此，CSFV完成其在宿主细胞中的一个生活周期。其中病毒RNA的3’UTR是复制过程中的关键调控位点[7-9]，NS3蛋白具有解旋酶活性，是CSFV基因复制必不可缺的因素[10]。

2 CSFV在体内外的增殖特性

CSFV在抗原性、病原性、病理特性、病变特征和遗传性等方面已呈多样化模式。病毒因素与宿主之间的相互作用决定CSFV感染的病程和结果，导致CSFV流行毒株在临床上呈现出强、中、低不同致病力特征[11]。急性CSF通常由强致病力毒株引起，在1到2周内致死感染猪；非典型和温和性CSF通常认为是由中等或低致病力毒株所致[12]。

2.1 CSFV在体内的增殖特性 经口鼻途径感染CSFV后，CSFV首先在猪的扁桃体隐窝上皮细胞增殖，随后扩散到周围的淋巴网状组织，并在局部淋巴结中增殖后到达血液，继而扩散到骨髓、内脏淋巴结、肠道相关淋巴组织、胸腺以及脾脏等组织器官。通常CSFV强致病力毒株在2天内就能够扩散到全身大部分组织器官，而对于CSFV低致病力毒株来说，丹麦学者Utenthal A等[13]在试验中发现接种Paderborn毒株后2 d血液也能检测到CSFV RNA分子，这说明不管是强致病力毒株还是低致病力毒株，接种后2 d病毒已经完成由扁桃体侵入到血液中进行少量增殖。CSFV在宿主体内感染的靶细胞种类主要是骨髓源的细胞[14]，尤其是单核细胞(Monocytes)和巨噬细胞(Macrophages)，这些细胞构成了病毒入侵宿主后早期感染靶细胞，随感染进程出现猪淋巴细胞缺失、血小板减少、凝血功能障碍和胸腺、骨髓萎缩等病理特征[15-16]，同时CSFV也对网状内皮细胞有很高的亲和性[16-18]。侵入宿主靶细胞是病毒起始生活周期的关键步骤，CSFV通过自身蛋白和易感细胞受体的结合侵入细胞。在脾脏中，CSFV可以侵入脾脏巨噬细胞、星状胶质细胞、网状细胞和淋巴细胞等。有研究证明，CSFV进入脾脏后最先在脾索巨噬细胞、边缘区边缘窦和动脉周围淋巴鞘中检测到CSFV E2蛋白，随后能在星状内皮细胞、中性粒细胞和脾脏淋巴细胞中检测到CSFV抗原，含有CSFV抗原的阳性细胞数量随病程发展而逐渐增加。在侵入过程中巨噬细胞数量在边缘区和脾索以及脾小结等区域随病程发展而显著性增加，一般在4～7 d达到峰值，7 d以后除边缘区以外其他区域巨噬细胞数量保持相对稳定。此外CSFV对猪的淋巴组织有嗜性，并可导致猪免疫系统的损伤[19]。在急性感染时，CSFV感染巨噬细胞和单核细胞，并且巨噬细胞支持CSFV的体内增殖。此外分子病理学研究还发现了慢性感染病程中CSFV的主要增殖场所为淋巴器官，且对其具有持续性的、不可恢复性的损伤，但对其他组织的损伤是可恢复性的。说明CSFV慢性感染病程中免疫器官的损伤是导致机体免疫失败的根本原因，从机制上揭示了免疫逃逸的原因[20]。CSFV感染后还会对中枢神经系统造成损伤，感染早期CSFV感染的细胞主要是端脑吻端的淋巴细胞和小胶质细胞，随后扩散到其他区域，血管周围浸润的淋巴细胞和间质细胞部分出现凋亡，并且在这些淋巴细胞中可检测到CSFV抗原。

2.2 CSFV在体外细胞中的增殖特性 CSFV在猪体内感染导致多种细胞发生病变，尤其强毒株能够引起急性猪瘟，出现高热、皮肤出血点、白细胞数快速下降等典型症状，致死率可达100%。在体外细胞中 CSFV 以低水平增殖，其在胞内增殖的主要部位是有丰富膜系统的细胞核周围。成熟的病毒粒子多见于细胞质中的膜囊中，有时可观察到在膜囊质膜处的开口以及周围的成熟病毒，表明CSFV可能通过这一特殊的结构向外释放[21]，且释放的大多数病毒依然吸附在囊膜的无定型基质中，但产生的子代病毒滴度较低[22]。CSFV在猪淋巴瘤38A1D细胞系上增殖，细胞上清中病毒滴度可达5×107TCID50/mL[23]。将CSFV Alfort187株感染PK-15 Cytodex 3微载体培养系统，可获得较常规单层细胞培养25倍的病毒量，且细胞可带毒传代，并在细胞分裂时将病毒传至子代细胞中。徐兴然等[2]对CSFV强毒株石门株在PK15细胞中的增殖特性进行了研究，结果显示在病毒感染后8 h 能检测到病毒蛋白的表达、病毒基因组复制中间体负链RNA 并能检测到具有感染性的病毒粒子，这表明CSFV增殖过程的“隐蔽期”约为8 h；在病毒感染后的8～36 h病毒蛋白合成速度较慢，而在48 h之后合成速度加快。结果还显示，在病毒感染后48～52 h，病毒滴度达到高峰, 随后病毒的感染滴度开始逐渐下降。田宏等[24]，采用间接免疫荧光法也对石门株在PK15细胞上的增殖特性进行研究，结果显示接毒9 h后培养细胞中的荧光充满胞质,并可清晰地勾勒出细胞核的形状；接毒24 h后，细胞中发出较强的荧光；CSFV石门株感染PK15细胞54 h后，感染细胞中荧光减弱。两个小组对CSFV强致病力毒株在PK15细胞上的增殖特性的研究基本一致，为CSFV石门株生活周期的阐明提供了可靠的数据。此外，田宏[24]利用直接荧光抗体染色法对C株在SK6细胞上的增殖规律进行了研究。结果发现在接毒8 h时，胞质中开始出现荧光斑；接毒9 h时，培养细胞中的荧光基本充满胞质，可显示出细胞的形状；感染12 h后，细胞质中荧光增强；24 h后，感染的细胞中释放出的子代病毒粒子扩散并感染了周围细胞，使被感染的细胞由单个存在发展为成团分布。48 h后几乎全部细胞均被CSFV感染，细胞中发出较强的荧光。而且早在2000年，王镇等[25]就对C株在原代牛睾丸细胞上增殖的基本特性和规律进行了研究，接毒后每隔12 h进行采样，结果显示与传代细胞相同，CSFV抗原主要存在于感染细胞的细胞质中[26]。接毒后12 h样品中检测不到荧光；接毒后24 h，样品中可观察到微弱的荧光；接毒48～72 h 样品中出现荧光较强的 CSFV 感染细胞，但阳性细胞数量只占整个细胞群体的少数，阳性率不超过10%。接毒后72～108 h是病毒感染细胞的迅速增长期，在这段时间里，阳性细胞率达到50%左右。以上研究结果显示，C株对不同的细胞系有不同的适应性，其增殖特性也会有很大的区别当C株感染SK6细胞时，在细胞群体中能快速的检测到感染的细胞，具有较快的增殖速度，此特点可以用于SK6细胞快速的检测疫苗株，用以区分疫苗株和其他毒株，也为疫苗株在细胞上增殖特性的研究提供了可参考的数据。

3 CSFV蛋白基因在RNA复制过程中的作用

CSFV包含4种结构蛋白：C、E0、E1和E2,7种非结构蛋白：Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，在病毒的复制和组装过程中起到重要的作用。同时有报道称C、E0、E1、E2、Npro、P7 和 NS2 蛋白对于病毒 RNA 复制是非必需的,而NS3、NS4A、NS4B 和 NS5A 会形成复制酶复合体与具有 RDRP(RNA 依赖性 RNA 聚合酶)活性的 NS5B蛋白共同参与病毒 RNA 的复制[27]。

其中E1和E2可以介导病毒粒子进入细胞[4],在外的E0和E2蛋白在病毒感染过程中对于吸附细胞具有协同作用，可以增强病毒的感染能力[28]。E2蛋白与E0蛋白不同的是，E0是与宿主细胞表面的特异性受体结合而E2是非特异性结合。最近有研究表明，结构蛋白E0在细胞内不仅可与宿主蛋白相互作用，还可与病毒的结构蛋白和非结构蛋白相互作用，在病毒感染和复制过程中发挥重要的作用[29]。除此之外E0还具有RNA酶活性，在病毒复制过程中的作用也非常重要。而贺番等[30]于2013年研究表明，E2的182～261位氨基酸和262～341位氨基酸两个区域与宿主细胞的β-actin的95～188位氨基酸区域相互作用，在CSFV复制的早期阶段起着重要的作用。

Npro是病毒编码的第一个非结构蛋白，但该蛋白对病毒在细胞中的复制并没有起关键的作用。研究中用鼠泛素基因将其取代，所得到的新的重组病毒的复制特性和亲代病毒类似[31]。有趣的是该蛋白在细胞内的运输会对病毒在复制周期的晚期造成一定的影响。李永峰在研究中构建了表达IRF3-Npro融合蛋白的突变体病毒vSM-IRF3和表达失去抑制干扰素产生功能的Npro-D136N的突变体vSM-D136N,结果显示病毒的复制在复制周期的晚期(36～72h)受到明显的抑制[32]。

体外实验证明NS2蛋白对于CSFV RNA的复制是非必需的，但是它具有调控病毒复制的能力，可以延长转染细胞中病毒RNA复制的时间[33]。同时2011年王茁[34]研究显示：将转染CSFV NS2基因的PK15细胞接种石门株，同时以正常PK15细胞做对照，在接种后24、48、72 h后收获病毒总RNA，结果显示在细胞含量相同的情况下前者病毒基因的拷贝数远远低于后者。而当病毒基因组缺失NS2时，亚基因组复制子在细胞中复制速度加快。

NS3蛋白具有多种功能，其RNA解旋酶活性和核苷酸磷酸酶活性功能是病毒基因组RNA复制必不可少的因素，此外还包括丝氨酸蛋白酶活性，三者相互协同对病毒的复制、组装也都起到关键的作用。如丝氨酸蛋白酶可以增强其解旋酶活性进一步可增强核糖体结合位点介导的翻译活性，而其活性的发挥又依赖于核苷酸磷酸酶为其提供能量。此外NS3可以通过丝氨酸蛋白酶结构域(30～70AA)与NS5B(63～99AA和611～642AA)结合，从而增强NS5B RNA依赖性RNA酶活性，反过来这种相互作用又可以同时调节NS3的NTP酶和解旋酶活性。关于NS4A、NS4B蛋白影响CSFV复制的相关研究还比较有限。 2007年Moulin等[35]研究NS4A是NS3蛋白的辅助因子，NS4A蛋白不但影响病毒RNA的复制，而且在感染性病毒颗粒形成过程中起重要作用。通过建立P7-RNA反转录聚合酶来表达P7-NS2-3-4A,在缺乏基因 NS2-3的情况下仍能产生感染性病毒粒子，说明 NS2 在复制中非必需,而NS4 与 NS2-3 和 NS3分别相互作用来影响病毒的复制。NS4B具有核苷三磷酸酶(ATPase和GTPase活性)活性，该功能是由A区域(209～216位氨基酸)和B区域(335～342位氨基酸)两段保守区域协调完成，且该活性在CSFV的生活周期中病毒的复制过程起到至关重要的作用。2011年，Gladue等[36]为研究区域A和区域B在CSFV复制中的作用，构建了一系列的突变病毒，其中包括CSFV Bresica株的全长cDNA克隆的NS4B蛋白NTPase酶活性的关键位点突变，将突变的cDNA与提取自野生型CSFV的RNA分别转染SK6细胞，培养后将其上清重新感染SK6细胞，只有后者检测到CSFV，前者的复制能力明显减弱,证明NS4B蛋白的核苷三磷酸活性与CSFV基因组复制密切相关。

NS5A是一种磷酸化蛋白，在CSFV的复制过程中NS5A的突变并不影响病毒的复制，但是当其被丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化后就会对其造成影响，同时它还可以通过调节NS5B与RNA 3’UTR区的结合影响病毒基因组的复制。但是当NS5A的浓度过高时，NS5A自身会与3’-UTR结合来抑制CSFV RNA的复制，相反低浓度的NS5A就会促使NS5B与3’UTR结合来促进CSFV RNA的复制。此外，在CSFV感染细胞的过程中NS5A蛋白可以介导并完成一个完整的自噬途径来增强病毒RNA的复制，自噬途径的一个重要的指示因子是LC3而CSFV感染细胞后使得LC3重新分布，2013年Pei等[37]将pEGFP-NS5A和pEGFP-N1空载体分别转染PK15细胞，结果显示pEGFP-NS5A与pEGFP-N1相比促进了宿主细胞内LC3的表达，最终使得RNA的复制效率增强。在体外昆虫细胞及猪肾细胞中的表达已证明NS5B具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，李维维[38]从细胞水平，分子水平和蛋白质水平探究了CSFV 的NS5B蛋白、C蛋白在CSFV复制中的作用。其结果显示：CSFV衣壳蛋白 C可增强NS5B蛋白的RNA 聚合酶活性。此活性在病毒的复制周期中起着至关重要的作用。在CSFV RNA的复制起始阶段，它可以识别并结合正链RNA的3’UTR形成负链RNA，再以负链RNA为模板形成正链RNA。NS5B除具有RNA依赖的RNA聚合酶活性外还具有末端核苷酸转移酶(TNTase)活性，研究表明黄病毒科的NS5B蛋白具有甲基转移酶活性，该活性在病毒的生活周期中发挥着巨大的作用[39]。

4 结语

近年来，研究者们一直致力于CSFV在细胞上的增值特性研究，以此来阐释CSFV在动物体内复制规律及致病机理，也对影响病毒复制的相关蛋白也做了进一步的研究。而本文通过CSFV在体内外的增殖特性及病毒蛋白在RNA复制中所发挥的作用，系统地阐明了CSFV在体内外机体中的增殖规律及特性，为更深入地了解CSFV在猪体内的复制规律奠定了理论基础，也为猪瘟疫苗在生产中的应用提供了一定的参考价值。

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(编辑：李文平)

Research Progress of Multiplication Characteristics of Classical Swine Fever Virus

ZHANG Yu-jie,XU Lu,ZHANG Qian-yi,WANG Qin*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

This article elaborated on the multiplication rule of classical swine fever virus(CSFV)from two aspects including the multiplication characteristics of CSFVinvitroandinvivo, and the virus proteins’ impacts on RNA replication in order to provide reference for the patheogenesis research of CSFV.

classical swine fever virus;multiplication characteristics;replication

张玉杰，硕士研究生，从事预防兽医学研究。

王琴。E-mail：wq551@vip.sina.com

2015-09-28

A

1002-1280 (2015) 11-0059-06

S852.65+1