宏基因组技术及其在奶牛乳房炎诊断中的应用

于景丽，希尼尼根，赵 吉

(1.内蒙古大学 环境与资源学院，内蒙古 呼和浩特 010021；2.内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；3.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021；4.农业部“动物疾病临床诊疗技术重点实验室”，内蒙古 呼和浩特 010018)

现代医学认为，疾病的发生发展与菌群结构变化密切相 关[1-4]。Aebi 等利用DNA 印迹杂交(Southern-blot hybridization)技术证明特定牛群支原体乳腺炎暴发和奶源介导的支原体群落感染有关[5]。发展不依赖于培养(Culture-independent)而且能够准确跟踪疾病发生发展过程中全部菌群变化的宏基因组学(Metagenomics)鉴别技术对疾病的早期防控至关重要。宏基因组学为直接提取指定环境中微生物群落总基因组(宏基因组，Metagenome)DNA，利用宏基因组学研究策略跟踪群落组成及丰度变化的新兴学科[6-10]。

近年来，宏基因组技术的迅猛发展极大促进了其在多种复杂环境中的广泛渗透，包括水、气、土等自然环境[11-13]和肠道、口腔、皮肤等高等生物体内及体表环境[14-16]。本文就宏基因组技术在奶牛乳房炎中的应用状况进行综述。

1 常规宏基因组技术鉴别奶牛乳房炎关联菌群变化

常规宏基因组技术主要包括①基于杂交的宏基因组技术；②基于指纹图谱及克隆测序相结合的宏基因组技术；③基于荧光定量PCR(qPCR)的宏基因组技术。qPCR 技术在奶牛乳房炎临床诊断中应用的实例很多[17-20]，但由于技术本身限制，qPCR 主要针对少数几类已知病原菌群进行检测，不能分析微生物群落结构。指纹图谱技术在定性分析环境微生物群落结构组成及多样性方面发挥重要作用，但不具备定量功能。

1.1 基于DNA 杂交的宏基因组技术 宏基因组学技术的核心为不依赖于培养的微生物群落基因组分析技术。荧光原位杂交(Fluorescent in situ hybridization，FISH)[21]、DNA印迹杂交[5]和基因芯片(Genechip)[22]技术均基于已知病原菌设计寡核苷酸探针，通过DNA 杂交技术检测奶样中病原菌群落数量的方法。Gey 等设计的FISH 寡核苷酸探针只能检测乳房炎奶样中高于106cfu/mL 的病原细菌群落数量[21]。因此，FISH 等杂交技术虽比传统培养方法操作快捷，但存在灵敏度不高，而且不能够鉴定新型病原菌等共性问题，在跟踪疾病关联菌群变化和疾病预防和诊断方面受到限制。

1.2 基于指纹图谱和克隆测序相结合的宏基因组技术DNA 指纹图谱技术包括末端限制性片段长度多态性(Terminal restriction fragment length polymorphisms，T-RFLP)[23]、变性梯度凝胶电泳(Denature gradient gel electrophoresis，DGGE)[24-26]、单链构象多态性(Single-strand conformation polymorphisms，SSCP)[27]等多种技术，但在奶牛乳房炎关联菌群分析中应用较少。Kuang 等采用DGGE 和克隆测序相结合分析日本北海道地区乳房炎奶样细菌群落组成及多样性，证明肺炎克雷伯菌、乳酸乳球菌、金黄色葡萄球菌和埃希氏菌属为北海道地区乳房炎奶样最主要的细菌属，而且细菌群落结构变化具有宿主特异性[24]。比利时布鲁塞尔地区未感染、亚临床和临床感染奶牛乳头皮肤细菌群落的DGGE 分析证明棒状杆菌属和葡萄球菌属为最优势的乳房炎致病菌[25]。由此表明，不同地区不同组织部位奶牛乳房炎病原菌群结构组成存在差异。高潮等通过DGGE分析证实乳样微生物区系结构越复杂，奶牛乳房炎的治愈时间越长越容易复发[26]。与传统培养分离鉴定和FISH 等核酸杂交技术相比，DGGE 技术揭示了奶牛乳房炎关联的较多微生物群落信息，涵盖可培养和大多数不可培养菌群，可以有效区分不同组织部位和不同健康程度乳样中菌群差异，为检测奶牛乳房炎关联菌群变化的较有效工具。

2 高通量宏基因组技术鉴别奶牛乳房炎关联菌群变化

2.1 高通量宏基因组技术的含义及特征 高通量宏基因组技术主要包括高通量测序(High-throughput sequencing)[1]和升级版功能基因芯片(Geochip)技术[28]。高通量测序技术一次能够实现大规模样品的平行测序，获得几十万甚至几百万条DNA 序列信息和高达500 Mb～600 Mb 的数据量(一代测序56 kb)，比Sanger 法一代测序通量提高了成千上万倍甚至上亿倍，测序速度提高了上百倍，可分辨极低丰度菌群，为短时间内准确测定微生物群落变化成为可能。已知Geochip 包括70 000 个功能基因，超过400 个功能基因类别。Geochip 5.0 含有11 416 个探针，覆盖26 000条序列。Geochip 在人类重特大疾病诊疗中发挥了重要的作用，虽未见应用于奶牛乳房炎的研究报道，但随致病基因的不断开发，Geochip 有望应用于奶牛乳房炎菌群变化研究。

高通量测序和Geochip 技术兼顾常规宏基因组技术菌群组成定性及定量分析双重功能，可以对来自不同地点和不同时间的批量样品进行平行分析，具有操作简单快速、效率和通量高、重复性好和精确度高等优点，为目前宏基因组学的主流技术。但两者稍有区别。Geochip 只能检测“封闭系统”中功能已知的微生物群落特征[28]；而高通量测序能够在“开放系统”中发现有价值的新型微生物资源，因此应用更为广泛。基于测序平台的差异，高通量测序主要包括：Roche 公司的454 pyrosequencing、Illumina公司的Solexa sequencing 和ABI 公司的Solid sequencing 等。

2.2 高通量测序技术鉴别奶牛乳房炎相关菌群变化 根据体细胞数量(SCC)将奶牛乳样分为5 个健康等级，通过宏基因组焦磷酸测序发现健康与乳房炎病例奶样均具有丰富的细菌群落组成，但群落组成存在明显差异[1]。在已分类的60 种细菌中，金黄色葡萄球菌和粪肠球菌等10 种细菌为健康牛乳中特有菌群的客观事实，颠覆了人们对常规致病菌的认识[1]。健康型和临床型乳房炎病例奶样细菌群落组成的高通量测序表明，鞘氨醇单胞菌属和寡养单胞菌属为乳房炎病例奶样中最优势的细菌属，分别隶属于变形菌门的α-和γ-变形菌纲；假单胞菌属和劳尔氏菌属为健康型奶牛乳样中最优势的细菌属，分别隶属于变形菌门的γ-和β-变形菌纲[29]。亚临床型乳房炎病例奶样病原菌群的高通量测序共检测到葡萄球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属和埃希氏菌属等23 个属和28 个细菌种，隶属于5 门、8 纲、15 目、19 科。其中，变形菌门和厚壁菌门为亚临床型乳房炎病例乳样中最丰富的细菌门[30]。奶样细菌群落的高通量测序表明，微生物群落组成及丰度变化和奶牛的健康状况密切相关[1,29-30]。

3 宏基因组技术在奶牛乳房炎诊断中的应用前景分析

常规和高通量宏基因组技术共同点为样品宏基因组DNA 的直接提取、目的基因的PCR、后续生物信息学分析等。不同点为常规宏基因组技术步骤相对复杂，需要构建基因克隆文库或运行DGGE 等指纹图谱切胶后再进行Sanger 测序。另外，常规宏基因组学技术中构建克隆文库需要挑选大量阳性克隆菌株，存在工作量大和覆盖度不高等问题。常规宏基因组技术中DGGE 受凝胶电泳条件限制，无法对罕见或稀有菌群进行检测，而且重复性和分辨率均不理想；qPCR 技术虽能定量但不能区分微生物的群落组成。高通量测序技术避免了常规宏基因组技术操作的复杂性和低分辨率及低通量等问题，可以直接对宏基因组进行测序，能够对整个菌群中不同丰度的组成进行全面系统的分析，信息量大而且能够有效区分不同健康等级样品的菌群组成，为检测大量不可培养的菌群、发现罕见菌群和寻找奶牛乳房炎相关致病菌群提供了有效的技术手段。

高通量宏基因组测序技术在奶牛乳房炎相关菌群研究中虽处于起步阶段，但在菌群组成多样性和丰度识别方面有质和量的飞跃。Oikonomou 等通过高通量测序一次性获得多达60 个已知种和将近50 %的未分类细菌种[1]。由于通量高、信息量大、准确性高等优点，高通量宏基因组测序技术能够准确跟踪奶牛乳房炎发生发展过程中菌群组成及丰度变化，并对不同健康等级乳样中稀有菌群和菌群间微细变化进行准确鉴别，证明特征性致病菌群组成与奶牛乳房炎发病间存在关联性[1,29-30]。因此，该技术将是未来鉴别奶牛乳房炎关联菌群的主流技术。国内深圳华大基因和上海美籍等公司宏基因组高通量测序及生物信息学已商业化。随着测序精确度的逐步提高和测序分析成本的不断降低，高通量测序日渐普及已走进国内各大高校和研究院所。宏基因组高通量测序技术有望大步迈向兽医微生物领域，实现奶牛乳房炎等畜病的准确跟踪、诊断和预防。

4 奶牛乳房炎关联菌群研究中存在的问题与展望

4.1 存在的问题 以非疾病为主要研究目的的牛体微生物宏基因组学几乎都围绕瘤胃或胃肠道等部位进行研究，其他组织部位微生物的宏基因组学少有涉及。以奶牛乳房炎为研究目的的牛体微生物宏基因组学都围绕病灶进行研究，样品多为牛乳，偶见乳头管、乳头皮肤。因奶牛乳房炎病原微生物大多为细菌，所以病原微生物宏基因组学主要为细菌宏基因组学、少有真菌或病毒宏基因组学。国内外奶牛乳房炎相关菌群的宏基因组学鉴别技术应用水平参差不齐，国内偶见乳房炎牛体微生物宏基因组学DGGE指纹图谱技术，国外已陆续使用高通量宏基因组学测序技术。虽然发达国家已开始启用高通量宏基因组技术进行测序分析，但后续生物信息学分析明显滞后。影响奶牛乳房炎关联菌群结构的基础资料极度缺乏，导致高通量技术获取的大量菌群信息不能真正服务于奶牛乳房炎的早期预防和精确诊治。

国内乳房炎关联微生物的研究基本定势在各类病原体的分离鉴定及药敏试验，相对缺乏菌群失调和发病关系的认识。目前，乳房炎微生物的研究思路多为“终端诊断的指标体系”，即通过病牛乳汁发现致病菌、找相应的药物，尚未摆脱“病后看病”的不良局面，缺少“病前预防”的“微生物预警指标体系”。乳房炎的发生与多种病原微生物有关，但乳房菌群间互生、共生、竞争、捕食、寄生关系对乳房炎发生的影响尚缺乏报道；尤其对临床型乳房炎病例病原菌的来源尚无明确的定论，这样我们无法采取有效的预防措施。

4.2 奶牛乳房炎宏基因组学研究展望 从理论上讲，患病动物病原菌有两种来源：外源性感染和内源性感染。部分内源性感染与寄生于肠道中的微生物有着直接的关系。研究证明肠道微生物具有体内移位或基因水平转移特性，理论上胃肠道菌群失调和乳房炎发病之间存在一定的关联性，但国际上缺乏胃肠道菌群失调和乳房炎发病关系的研究证据。在国际刊物Nature 中大量刊载了人体肠道菌群变化和人体健康关系的报道，证明肠道菌群结构受饮食结构、生物钟等因素影响。为此，在乳汁离体前就能预测到致病菌有进入乳汁的倾向，并且通过宏基因组文库筛选出易感性的致病基因，可以通过基因干预或阻断方法达到疾病早期防控之目的。

本着“敏感预警”和“预防为主”的原则，权衡人力物力和经费状况，倡导敏感部位多时段微生物群落的跟踪式研究以筛选易感性生物标志。反刍动物胃肠道为微生物最活跃代谢活性物质最为集中的部位。牛肠道微生物群落不仅关系到牛体健康和生产力，还与食品安全和环境健康密切相关[31]，可能为机体健康状况的敏感部位。建议借鉴人类肠道菌群宏基因组学在人类疾病研究的成功经验，从群落全基因组水平研究奶牛肠道微生物群落结构与乳房炎发生发展关系，探索奶牛乳房炎发生的微生物群落致病机制，筛选新型致病菌或抗病基因等易感性生物标志。初期研究以掌握微生物宏基因组学方法和策略为主，用宏观生态学理念逐步开展多区域多时段的微生物群落的时空异质性研究。后期研究则针对牛体不同部位进行不同时间段的跟踪研究，以期在奶牛乳房炎微生物群落致病机制探究、生物标志挖掘、新型致病或抗病基因等方面有所突破，筛选重要的易感性生物标志，为今后制定健康牛标准提供微生物指标体系，最终达到奶牛乳房炎提早预防、精确诊断、对症治疗的目的。

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