PRU株弓形虫感染小鼠后脑组织免疫病理的研究

吴升伟，胡国顺，王正蓉，包怀恩

PRU株弓形虫感染小鼠后脑组织免疫病理的研究

吴升伟1，胡国顺2，王正蓉2，包怀恩2

目的 了解弓形虫PRU株感染小鼠后脑内局部细胞因子对脑组织的免疫病理作用。方法 51只ICR小鼠分为感染组(33只)和对照组(18只)，感染组经腹腔注射弓形虫PRU株10个包囊/鼠，对照组腹腔注射同等量的PBS。于感染后第5 d、10 d、15 d、20 d、30 d和90 d，剖杀感染组小鼠5只和对照组小鼠3只，取脑组织，部分作病理切片；部分提取其RNA，检测IFN-γ、IL-4、IL-6和TNF-α mRNA；部分获取脑组织上清液，用ELISA法测定上述细胞因子。结果 相对于正常对照组，感染小鼠脑组织中IFN-γ于感染后第5 d 开始升高，第10 d时下降达到最低，之后开始上升；TNF-α在感染第10 d或15 d时明显降低，接着上升并于第30 d时达到高峰；IL-6在感染第5 d时开始升高，感染第10 d时降至最低，之后缓慢上升，并于第30 d后达到高峰；IL-4未见明显变化。结论 弓形虫PRU感染ICR小鼠的过程中，脑组织中IFN-γ、IL-6和TNF-α细胞因子在感染第10 d或15 d的低表达有利于弓形虫逃避宿主的免疫杀伤作用，导致速殖子在脑组织中存活；同时细胞因子的分泌不平衡，导致小鼠脑组织中出现弓形虫包囊与病理变化共存的隐性感染状态。

弓形虫PRU株; 免疫病理；细胞因子

弓形虫病是由刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)感染引起的严重危害健康的一种人兽共患性疾病。弓形虫是重要的专性细胞内寄生的机会性致病原虫，且具有亲神经性的特点，脑组织是弓形虫最易侵犯的部位之一[1]。

以往的研究显示，强毒株弓形虫急性感染小鼠时，在宿主体内会出现细胞因子Th1/Th2亚群比例的变化，表现为两类细胞因子水平从Th1占优势转向Th2的偏移，这对于疾病的发展和预后具有重要意义[2]。此外，还发现弱毒株弓形虫(例如PRU株)感染小鼠后，可在脑组织中形成包囊，并持续存在[3]。然而在此过程中，脑内局部细胞因子是否发生了变化，以及它们对脑组织的病变及包囊形成的影响尚未阐明。

本实验以弓形虫PRU株感染ICR小鼠，观察脑组织病理变化，并分别从基因水平和蛋白水平检测小鼠脑组织部分细胞因子的变化，探讨弓形虫感染后细胞因子介导的脑组织的免疫病理损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄SPF级ICR雌性小鼠，体重20～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(小鼠许可证编号SCXK(京)2006-0009)。

1.2 虫株 弓形虫PRU株由蚌埠医学院孙新教授惠赠，本室在昆明小鼠体内传代保种。

1.3 主要试剂 TRIzol RNA提取试剂购自Invitrogen公司， sample protector样品稳定剂、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒等购自大连宝生物工程有限公司，IFN-γ、IL-4、IL-6和TNF-α ELISA KITS 购自cusabio生物公司。

1.4 实验动物感染及样本的保存 51只ICR雌性小鼠分为感染组(33只)和对照组(18只)，感染组小鼠经腹腔注射弓形虫PRU株10个包囊/鼠(于试管内用无菌PBS调整至0.5 mL)，对照组小鼠腹腔注射同等量的PBS，每笼5～6只鼠，分别分笼饲养，正常取食及饮水。试验期间每天观察和记录小鼠发病情况，并于感染后第5 d、10 d、15 d、20 d、30 d和90 d，处死感染组小鼠5只和对照组小鼠3只，剖解小鼠，取脑组织，其中部分脑组织于10%中性甲醛溶液固定24 h，按常规方法进行脱水、石蜡包埋，制作4 μm切片，作HE染色；部分脑组织保存于sample protector样品稳定剂中，-20 ℃保存，用于细胞因子的Real time PCR检测；部分冻存于-80 ℃，用于ELISA法测定脑组织上清液中细胞因子的含量。

1.5 脑组织RNA的提取 用TRIzol法进行提取，并用Gene Quant核酸定量仪进行纯度和浓度的测量，确保RNA的A260/280在1.8～2.0之间。

1.6 实时荧光定量PCR的检测

1.6.1 引物的设计和合成 采用Primer 5.0软件设计IFN-γ、IL-4、IL-6和TNF-α细胞因子引物，见表1。

1.6.2 Real Time PCR反应 实验前先将RNA反转录为cDNA，Real Time PCR反应体系为SYBR PremixEx Taq(2×) 10 μL，10 μm PCR primer 1.6 μL，ROX Refernce DYE(50×) 0.4 μL，cDNA模板5 μL，灭菌ddH2O 3 μL，总体积20 μL。反应条件为50 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，95 ℃15 s，60 ℃ 15 s。每个细胞因子检测3个生物样本，每个生物样本重复3次。

1.6.3 结果与计算 各样品的目的基因和管家基因分别进行Real Time PCR反应。采用2-ΔΔCt法计算两组之间基因的差异表达倍数，即两组间基因表达拷贝差异为2-ΔΔCt倍，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。

1.7 ELISA法测定

1.7.1 脑组织上清液的获取 将保存于-80 ℃冰箱的脑组织取出解冻，按0.1 g脑组织加入1 mL PBS充分匀浆， -20 ℃两次冻融以破坏细胞膜，后以4 ℃ 12 000 r/min离心20 min收集上清，分装于-20 ℃以用于检测。

1.7.2 ELISA法检测脑组织中细胞因子 采用双抗体夹心ELISA法检测组织上清中细胞因子水平，最后用酶标仪在450 nm处测定各孔OD值，然后以标准品的OD值为X轴，浓度为Y轴绘制标准曲线。根据标准曲线，计算细胞因子含量(pg/ mL)。

1.7.3 统计学处理 实验数据以均数±标准差表示，实验组和对照组的显著性检验采用SPSS16统计软件分析处理，多组样本均数比较采用方差分析。

2 结 果

2.1 感染鼠发病及脑组织病理学改变 感染鼠从第6 d开始出现食欲减退、耸毛、怠惰、抖动、腹泻及死亡等临床症状，第20 d后症状开始减轻。HE染色镜下第10 d起见明显的神经元变性、卫星现象及噬神经现象，第15 d起见神经胶质结节及较小的弓形虫包囊，第20 d起珠网膜下腔见炎症细胞浸润，第90 d时珠网膜下腔见肉芽组织。具体参考文献[4]。

2.2 感染鼠脑组织细胞因子实时荧光定量PCR检测 与正常对照比较，感染弓形虫PRU株小鼠脑组织中IFN-γ、TNF-α和IL-6 mRNA均明显上升。IFN-γ于感染第10 d时下降，之后开始上升，于第20 d时达到高峰；TNF-α于感染第5 d时降至较低，第10 d时开始升高，第15 d时又明显降低，接着上升并于第30 d时达到高峰；IL-6在感染第5 d时是比较高的，第10 d时降至最低，之后缓慢上升，并于第30 d达到高峰；4种细胞因子中IL-4的mRNA表达量是最低的，并且包括阴性对照在内的几个时间点均没有检测出该细胞因子的mRNA。各试验组与正常对照组分别进行比较，IFN-γ、TNF-α和IL-6细胞因子的CT值变化差异具有统计学意义(F=39.377P<0.001；F=450.042P<0.001；F=176.953P<0.001 )。参见图1。

2.3 感染鼠脑组织上清中细胞因子的ELISA法检测 实验发现，相对于正常对照组，感染组小鼠脑组织上清中IFN-γ、TNF-α和IL-6明显升高。IFN-γ于感染后第5 d开始升高，第10 d时降至低于正常对照组浓度，达到最低，接着开始一直升高直至实验结束；TNF-α在感染第5 d时开始升高，第10 d时明显降低，接着开始明显升高，到第30 d时达到最高峰；IL-6在感染第5～15 d时与正常对照组比较变化不大，在经过感染第10 d时的最低峰后，感染第15 d后开始上升，直至感染第90 d均保持在一个高值；IL-4是4个细胞因子中变化幅度最小，几乎都围绕阴性对照值上下波动。各试验组与正常对照组分别进行比较，IFN-γ、TNF-α和IL-6细胞因子的浓度差异具有统计学意义(F=2.815P=0.025；F=9.620,P=0.000；F=3.124,P=0.015 )，而IL-4浓度差异无统计学意义的(F=1.687,P=0.154)。参见图2，图3。

图1 感染小鼠脑组织中IFN-γ、TNF-α和IL-6 mRNA的表达

Fig.1 The mRNA express of IFN-γ, TNF-α and IL-6 in brain of infected mice

Fig.2 Kinetic change of IFN-γ and TNF-α in the brain tissue supernatant

Fig.3 Kinetic change of IL-4 and IL-6 in the brain tissue supernatant

3 讨 论

现已明确，以表达IFN-γ和IL-2为代表的Th1 亚群细胞具有增强杀伤细胞的细胞毒性作用，诱发迟发型超敏反应介导的机体细胞免疫应答；而以表达IL-6 和IL-4 为主的Th2 型细胞则主要是促进抗体产生，介导机体体液免疫应答[5]。本实验发现，感染弓形虫PRU株第10 d至15 d时，小鼠出现食欲减退、耸毛、腹泻及死亡等症状，镜下脑组织出现变性及坏死等变质病理改变，此时脑组织细胞因子检测发现IFN-γ和TNF-α在基因水平和蛋白水平表达均较低，即Th1介导的细胞免疫应答处于较低状态，感染小鼠细胞免疫功能低下，小鼠出现死亡等症状。随后IFN-γ和TNF-α表达开始升高，特别是IFN-γ的升高明显，小鼠度过急性期，逐渐进入恢复，镜下见弓形虫包囊、胶质结节及肉芽组织等增生病理改变。除外Th1亚群细胞表达的细胞因子量的变化，Th2亚群细胞表达的细胞因子也发生了改变：IL-4未见明显变化，IL-6在感染第10 d至15 d表达最低，之后开始上升。IL-6可作为一种重要的炎性介质与其他细胞因子协同作用，加重弓形虫感染后的免疫病理损害[6]。

正常情况下, 机体的Th1/ Th2 细胞处于动态平衡。在特异性抗原刺激下，这种动态平衡将被打破，发生了Th1/ Th2 细胞亚群间的飘移，这种变化影响机体的免疫功能，并与感染状态及病程等密切相关，最终使弓形虫逃避了宿主的免疫杀伤作用，并在脑组织中存活下来。资料显示，弓形虫感染宿主后，优先侵犯宿主脑组织，并能通过细胞和体液免疫诱导局部免疫应答，产生致炎细胞因子和抗炎细胞因子，导致宿主-寄生虫的关系失衡[7]。若小鼠度过急性期后存活下来，则Th1/Th2基本恢复平衡，小鼠进入隐性感染状态，同时出现弓形虫包囊与脑组织病理改变共存的现象，即抗感染免疫与弓形虫感染处于平衡状态。

大脑是常见的弓形虫包囊潜伏部位，其特殊的解剖结构导致脑组织局部细胞因子变化与外周不同。Hunter[8-9]等用PCR法检测脑组织中细胞因子的变化，发现所有的感染弓形虫的脑炎小鼠均能检测到TNF-α、IL-1α、IL-1、IFN-γ和CD4标记物的转录物，而IL-2和IL-4转录却不能被检测到。这些细胞因子能引起脑膜的炎症，并可能在弓形虫脑炎的免疫病理中起重要作用，这与本研究所观察的结果类似。在中枢神经系统中，细胞因子激活小胶质细胞在宿主防御弓形虫播散方面起到非常重要的作用[10]。资料显示，IFN-γ与TNF-α在小神经胶质细胞杀死弓形虫的过程中起到了重要的作用，它们能够激活小神经胶质细胞来阻止弓形虫的复制以及引起细胞毒性T细胞溶解受感染的细胞。Benedetto等[11]研究了重组肿瘤坏死因子(rTNF-α)和催乳素(PRL)对鼠弓形虫感染小胶质细胞的影响。发现TNF-α和PRL通过小胶质细胞上调了抗-细胞间粘附分子-1 (Anti-ICAM-1)的表达和内源性IL-3和IL-6的生成，它们可诱导抗寄生虫的功能，抵抗脑中鼠弓形虫感染。本实验中观察到IFN-γ与TNF-α升高，这些升高的细胞因子可能能够激活小神经胶质细胞来阻止弓形虫的复制以及引起细胞毒性T细胞溶解受感染的细胞。

通过对感染弓形虫小鼠脑组织细胞因子水平进行检测，可能通过局部产生的细胞因子量的变化来反映了细胞因子涉及到感染的免疫发病机制及间接抗弓形虫活性，这将有助于进一步全面揭示弓形虫脑炎的免疫机制。

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Cerebral immunopathogenesis of mice infected withToxoplasmagondiiPRU strain

WU Sheng-wei1,HU Guo-shun2,WANG Zheng-rong2,BAO Huai-en2

(1.GuizhouProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Guiyang550004,China;2.DepartmentofParasitology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China)

To learn the brain immunopathogenesis in mice infected withToxoplasmagondiiPRU strain with the cytokines in the tissue, 51 mice were grouped into the infected and the control. Thirty-three ICR mice were infected intraperitoneally with cysts, and 10 cysts in each, 18 mice were injected with PBS as control. Five mice from the infected and three from the control were sacrificed under anesthesia on 5 d, 10 d, 15 d, 20 d, 30 d, and 90 d post-infection (p.i.), and the brain tissues were collected for hematoxylin-eosin (HE) staining and RNA extraction followed by examination of IFN-γ, IL-4, IL-6, and TNF-α with real-time PCR. The rest of the tissues were subjected to ELISA for the cytokines detection. Comparing with the control, IFN-γ in the infected mice began to rise on 5 d, decreased to the lowest on 10 d, and then began to raise again p.i. TNF-α began to decrease obviously from 10 d to 15 d p.i, and reached its highest level on 30 d p.i. IL-6 increased on 5 d p.i, and then decreased to the lowest on 10 d p.i, then rose slightly and reached the highest on 30 d p.i. No remarkable alteration of IL-4 was noted. ICR mice infected withT.gondiiPRU strain presented an obviously down-regulated expression of IFN-γ, IL-6 and TNF-α from 10 d to 15 d p.i, which might help the parasites survive from the host immune challenge. Additionally, the timing phase of cytokines expression may be responsible for the cyst formation and latentT.gondiiinfection.

ToxoplasmagondiiPRU strain; immunopathogenesis; cytokines

Bao Huai-en, Email: bhe@gmc.edu.cn

包怀恩，Email: bhe@gmc.edu.cn

1.贵州省疾病预防控制中心，贵阳 550004； 2.贵阳医学院寄生虫教研室，贵阳 550004

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.011

R531.8

A

1002-2694(2015)01-0049-04

2014-03-20；

2014-10-20